作者cloneting (1ting)
看板Biotech
标题Re: [求救] 定序问题求救~~~~
时间Wed Mar 12 18:07:15 2008
※ 引述《rangelovero ( L'Arc~en~Ciel)》之铭言：
: ※ 引述《rvnkhlnomgtl (或许天堂也常日落)》之铭言：
: : 最近忙着定序的工作
: : 我们实验室的习惯是,先PCR後跑电泳,再切下band送定序
: : 但不知道为什麽,电泳图明明显示清楚的条带,我也保证切胶的过程与保存没有问题
: : 但源资(定序公司)竟然送来的资料是全军覆没....让我没法接受
: : 打电话去公司说请我再重送一下...但大家也都知道taq的消耗量很大
: : (总共有39管)
: : 实在很不好意思拿着定序服务失败的收据单给老板签名啊!!!!
: : 所以想请问大家...电泳图能拍得出来并切下该条带的胶送定序没法定序的情况是
: : 有可能发生的吗???
: : 另外想请问大家都是给哪一家定序的呢?
: : 明欣的风评如何呢?如果可以也顺便给我报个价~~~谢谢~
: 我之前有过类似经验
: PCR产物有两三条BAND(当中包含我的目标大小)
: 所以很自然地就挖胶纯化所要的片段
: 接着再进行TA CLONING→定序
: 不过不管作几次就是无法 TA 成功 (平常 TA cloning 是很基本的工作)
: 於是退而求其次 直接将纯化完的产物送定序
: 也就是跟你一样的步骤 结果也跟你一样 一堆杂讯 = =+
: 业务跟我说不要纯化了 直接给他 PCR 产物
: (他说以他们的经验来看 PCR 产物会比较好定)
: 虽然不相信 但也没别的办法了XD
: 结果还真的定出来罗
: 当然我不是建议你送 PCR 产物
: 只是想说如果纯粹要确定是否有放出正确产物
: 那应该还有其他条路可走(像上面说的)
: 不过TA cloning 是最保险也最易定成功的方法
: 你也许可以试试！
可能是你给的primer不适合定序
定序机器限制 primer的Tm最好是50-55度
如果PCR出来两三条band 不纯化直接TA cloning
再去colony PCR去挑含有你要的目标片段会比较容易
我也曾先挖胶纯化後在TA cloning 不知道为什麽做不出来
但如果不先纯化 直接做几乎都会成功
试试看吧
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.74.19
1F：推 MrCAKE:很好奇 原po指的是"不纯化" 还是"不切胶直接纯化"? 03/12 22:36
2F：推 satasumi:以我们的经验..直接送pcr产物会比较好处理 03/13 01:39
3F：推 MrCAKE:我是在想原p所言"不纯化直接TA cloning"是什麽意思 03/13 12:17
4F：推 rvnkhlnomgtl:那个Primer我并不是第一次送哦~送了好几次了,而且我 03/13 16:42
5F：→ rvnkhlnomgtl:来再送一批,定序结果是成功的....就是很无解的情况! 03/13 16:43
6F：推 rangelovero:不纯化我想是指PCR产物不纯化 直接取2 or 3uL去TA 03/13 16:48