作者rangelovero ( L'Arc~en~Ciel)
看板Biotech
标题Re: [问题] 关於restriction enzyme digest
时间Fri Feb 22 20:52:52 2008
※ 引述《snowypuppy (啦啦啦....)》之铭言：
: 想请问大家
: 我现在用EcoR1及HindIII将vector及insert做RE digest
: 做ligation之後长出来的怎麽挑colony却都是vector的size
: 怀疑是vector没有切乾净 (我是取5ug 切2小时) 之後做gel purify
从这里看来应该是没有被切开的vector直接转到host
使得你後来挑到的点都是vector
5ug太多啦 不然你就分开切
NEB的enzyme通常是1ug DNA 加 1ul的酵素可在一小时内作用完成
一小时是平均值 会随着酵素不同而改变
你使用的EcoR1及HindIII都还满好切的啦 只是5ug真的有点大量
: 问题是两个enzyme切下来的片段距离很小 只有20-30bp
: 使我无法在跑胶时确认是否切乾净
: 不知道有没有其他办法可以确认
: 或是实验步骤需要改进的地方 感谢大家!
那我建议你分开切了
切完其中一种再跑胶确认是否为原vector linear的大小
找到两种酵素截切完全的最佳时间
如果是没切乾净 挖胶後ligation应该是一颗colony都没
只要找到最佳截切时间 colony可是多到数不完
这绝对是个关键
祝你成功T^T
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◆ From: 140.112.74.19
1F：推 zyxz:再找一种酵素把不要的片段切成两半 这样就可以分开啦 02/24 23:35