作者kws6874 (煜凯)
看板Biotech
标题[求救]molecular cloning
时间Wed Feb 20 23:56:40 2008
最近经由RT-PCR方式要 clone 一段1480bp的片段到pcDNA3.1(-)的vector上..
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确认原先primer已设计Bam HI与Eco RV位置无误外,另外还在尾端多增加7mers作为
提升PCR products digestion efficiency...
可是..藉由37度C最佳buffer作用2小时及纯化後..再以insert:vector > 6的ratio进行
ligation及transformation竟然没长半颗clones...实验所使用的enzyme及competent
cells都已再三确认其功效无误... 但试了几次都结果失败...
另外,则是以T-A cloning方式进行cloning... transformation结果是OK...也看到
colonies长出来.. 但经由蓝白筛过滤挑选剩余colonies进行PCR check ..始终没挑到
想要的clones..
请大家帮帮我想一下问题可能是出在哪个地方.. 感激不尽...
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