※ 引述《leoblack (朋友看太重的猫)》之铭言： : 如题 : 现在我想要作double digestion : 所选用的RE分别是ApaI和XmaI : 两个特性都是用buffer 4 + BSA : 但问题来了 : ApaI作用时需要在25℃,如果在37℃,则half-life为30分钟 : 而XmaI作用所需温度为正常的37℃ : 所以我想问~有没有说先切温度高的再切温度低的这种建议?! : (我是要2种RE分次切,并没有要同时加在一起切) : 个人第一个直觉是想先切温度低的再切高的 : 这样incubator温度设定可以一路往上加,不用先加温再降温 : 好啦~我承认我真的有些龟毛^^"~ : 感谢了 我的看法是这样, 先切XmaI@37℃,再补buffer+BSA跟ApaI,切ApaI@25℃ 建议你看NEB的目录说明然後跟其他人讨论之後再决定 因为要看XmaI@25℃会不会出问题 给你我的经验,切SfiI@50℃ in buf#2 + SalI@37℃ in buf#3 NEB的目录上写SfiI@37℃只有10%活性且在buf#3也只有10%活性 我的实验室这样做 1.先切SfiI@50℃ in buf#2 total 20uL (时间就自己决定) 2.补NaCl,Tris-HCl,BSA 把buf#2 total 20uL盐浓度补成buf#3 total 30uL 3.补SalI切37℃ 4.SfiI在buf#3@37℃还留有1%活性 参考看看 --

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