※ 引述《leondemon (狗狗)》之铭言： : 三重复的意义何在？？？ : 为什麽要做三重复？？？ : 三重复要怎麽做？？？ : 最近因为这个问题，跟我很在意的人闹得有点不愉快 : 因此想听听这边的前辈的解答。 : 我说说我的看法。 : 我觉得三重复的意义，在於要确定每次的做出来的结果是一致的。 : 应该说，任何实验，都要确定其「再现性」，才能说这个结果是有意义的。 : 因此，我有看过讲究一点的paper，他们有测试同样的reaction在不同时间上机， : 来确保机器在不同的时候上机，其结果会有差异。 : 而我觉得三重复的配法，应该是要除了cDNA以外的reagents先混合配好加入各well中， : 然後再取三次cDNA，分别加入三个reaction中，证明每次取的cDNA都能做出一致的结果。 : 因为PCR反应中，cDNA的初始浓度，应该是影响结果差异的最主要原因， : 所以针对cDNA做不同的三次加入的三重复，来确定人员没有操作失误， : 而除了cDNA以外的reagents先mix在一起，是要做到「在相同环境下，测试一个可能变数」 : 所以如果做出来的扩增曲线是重叠的，那表示三次的操作都没问题， : 若是有一条没重叠，表示那次的pipetting可能有问题，於是排除该数据； : 若是三条都没重叠，则表示结果不一致（无再现性），因此该组数据都不能用。 : 上面是我的看法，但是我听到有人的三重复作法跟我不同。 : 他们是将所有的试剂混合在一起，这包括了cDNA、primer、和SYBR GREEN master mix， : 混合好後，直接分装到三个well中，然後跑出来的扩增取线很完美的重叠。 : 可是我却觉得这样做已经失去了「三重复」的含意， : 只是为了做「三重复」而做的「三重复」。 : 因为他们从tube里面只取了一次cDNA到整个mixture中， : 这样的三重复，就不能证明，「下次再做一样的实验，扩增曲线会是一样的情形」 : 因为他们没有做「不同次数抽取cDNA时，其扩增曲线是一样的」 : 毕竟cDNA的初始浓度稍有不同（可能是pipetting或人员操作技术导致）， : 其结果可能就会有明显差异。 : 我觉得他们那样的作法，只是把「同一个reaction，在同一台机器上跑三次」 : 能证明的，顶多只有「这台机器很稳定，因为在不同的well位置，其热循环结果一致」 : 可是要证明这个做什麽呢？ 这不是这台机器「基本」应该具备的条件吗？ : 对每个reagent只有做一次pipetting，那要如何表示这个反应的「再现性」？ : 根据我的实验经验和speciallist的指导， : 要降低cDNA的pipetting error，最好的方式就是先稀释整个cDNA来源， : 充分混合均匀（vortex & spin down）後，再取cDNA加入各reaction中。 : 这样可以使原本可能只要加 0.5 ul的cDNA，变成加入 5 ul（因为cDNA稀释10倍）， : 这样pipetting时，一些的些微误差，会因为取的体积变大而降低变异系数（差异百分比） : 我想听听看各位前辈对这两种三重复作法，有什麽样的见解？ : 哪一种方法是正确的？ 还是两种都正确？ : 谢谢～ 话说 我已经硕三 老板说年底会让我毕业~~ 我做了40个基因的real-time 每个基因独立作了3~5次(不同次抽的cDNA) 每次独立实验做了两重复 结果 error bar画出来很大 我跟老板讨论 他讲电话又讲skype 把我晾在一边很久 最後看一看计算公式 然後说 花这个时间想怎麽算 还不如重做 别浪费脑力想.......... 重做每次重复3次 他是当我是机器人吗?? 难道真没有别的方法?? --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 140.120.213.164