※ 引述《leondemon (狗狗)》之铭言： : 三重复的意义何在？？？ : 为什麽要做三重复？？？ : 三重复要怎麽做？？？ : 最近因为这个问题，跟我很在意的人闹得有点不愉快 : 因此想听听这边的前辈的解答。 : 我说说我的看法。 : 我觉得三重复的意义，在於要确定每次的做出来的结果是一致的。 : 应该说，任何实验，都要确定其「再现性」，才能说这个结果是有意义的。 : 因此，我有看过讲究一点的paper，他们有测试同样的reaction在不同时间上机， : 来确保机器在不同的时候上机，其结果会有差异。 : 而我觉得三重复的配法，应该是要除了cDNA以外的reagents先混合配好加入各well中， : 然後再取三次cDNA，分别加入三个reaction中，证明每次取的cDNA都能做出一致的结果。 : 因为PCR反应中，cDNA的初始浓度，应该是影响结果差异的最主要原因， : 所以针对cDNA做不同的三次加入的三重复，来确定人员没有操作失误， : 而除了cDNA以外的reagents先mix在一起，是要做到「在相同环境下，测试一个可能变数」 : 所以如果做出来的扩增曲线是重叠的，那表示三次的操作都没问题， : 若是有一条没重叠，表示那次的pipetting可能有问题，於是排除该数据； : 若是三条都没重叠，则表示结果不一致（无再现性），因此该组数据都不能用。 : 上面是我的看法，但是我听到有人的三重复作法跟我不同。 : 他们是将所有的试剂混合在一起，这包括了cDNA、primer、和SYBR GREEN master mix， : 混合好後，直接分装到三个well中，然後跑出来的扩增取线很完美的重叠。 : 可是我却觉得这样做已经失去了「三重复」的含意， : 只是为了做「三重复」而做的「三重复」。 : 因为他们从tube里面只取了一次cDNA到整个mixture中， : 这样的三重复，就不能证明，「下次再做一样的实验，扩增曲线会是一样的情形」 : 因为他们没有做「不同次数抽取cDNA时，其扩增曲线是一样的」 : 毕竟cDNA的初始浓度稍有不同（可能是pipetting或人员操作技术导致）， : 其结果可能就会有明显差异。 : 我觉得他们那样的作法，只是把「同一个reaction，在同一台机器上跑三次」 : 能证明的，顶多只有「这台机器很稳定，因为在不同的well位置，其热循环结果一致」 : 可是要证明这个做什麽呢？ 这不是这台机器「基本」应该具备的条件吗？ : 对每个reagent只有做一次pipetting，那要如何表示这个反应的「再现性」？ : 根据我的实验经验和speciallist的指导， : 要降低cDNA的pipetting error，最好的方式就是先稀释整个cDNA来源， : 充分混合均匀（vortex & spin down）後，再取cDNA加入各reaction中。 : 这样可以使原本可能只要加 0.5 ul的cDNA，变成加入 5 ul（因为cDNA稀释10倍）， : 这样pipetting时，一些的些微误差，会因为取的体积变大而降低变异系数（差异百分比） : 我想听听看各位前辈对这两种三重复作法，有什麽样的见解？ : 哪一种方法是正确的？ 还是两种都正确？ : 谢谢～ 小弟不是前辈 但是我有不同的看法 不冗述 但就leondemon所提到的SyBr Green方式 一般在萤光侦测上 似乎一直为人诟病 相对於Taqman 它的三重复似乎更应该跟您朋友的方式一样那样做 取萤光侦测平均值减少3well之间的误差 在统计上的意义 小弟个人浅以为 执着於同一个体上基因的实验三重复性的重要性 远不及在多个个体取样後得到具再现的实验结果 假设针对实验个体上某基因因特别因素而造成的表现改变 使用您朋友的方式应该效率是较高的 因为若要在cDNA or RNA上取sample所可能造成起始浓度的问题上计较 那麽在更前面阶段的分光光度计侦测就可能造成整体浓度计算的误差了 根本的吊诡在於 您的实验组与对照组 承担一样的取样时的误差风险 但是小弟绝不是否定您的方式 若能在个体三重复上 及多个体的再现取得的统计意义 肯定是更不能否定的数据 --

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