※ 引述《qumai (._.)》之铭言： : 借用一下文章 : 刚好也有这样的问题^^a : : 先养到1L, (e.g. M9) OD>1.0 (2g α-D-Glucose/Glc) : 请问是一开始就加入2g α-D-Glucose/Glc : 然後养到OD>1.0吗 Yes. 嗯。但实际上在inoculate的过程中，可以测试最大 OD_600nm. 像以正常的 x mL LB->20/50mL M9->1L M9，这个20 or 50mL 就可以大概知道这次的medium and colony可以长到最多多少， 当然这会让你slightly over-grown，不过基本上看到OD掉了， 就立刻换1L应该影响不大。 以BL21(DE3)pLysS来说，用glycerol stock勉强可以，但仍以 fresh transformation最佳。测试条件如果是表现问题，应该 用最高品质来试比较容易抓到条件。 我在用的M9（网路上有很多版本） 1. Na2HPO4(anhydrous) 67.8g (10x M9) 2. KH2PO4 30g 3. NaCl 5g 4. 调整pH，如果是要用isotope NH4Cl的话，否则可以和NH4Cl一起调到pH7.4 至於5x or 10x都可以，但都会有不等的沈淀，对我的系统来说并不影响结果。 如果你不放心，那就每次都新配→autoclave. 5. Glc=4g (2g+2g), 全部都是先配Glc=2g, 只有最後要加 IPTG才把剩下的2g 加给菌吃。 过程就是→ xmL LB OD_600nm =0.5~3.0/OD here should be OK (not critical), (spin down) 20/50mL M9 OD_600nm~OD_max (spin down or not for lazy people like me) 1L M9 reaching OD_max ->add more Glc and IPTG at the same time. 这种作法的缺点是：菌一定要耐得了overgrown, 而且菌的品质要好， 再来OD_max不一定是induce的最佳条件。 不过因为表现出来的蛋白可能有毒，所以就以最大菌数来撑蛋白产量， 表现到菌死掉那就无所谓了。 因此，如果你的蛋白要养到>10小时才会出来，那就可能不适合这样作。 好处…好处就是菌会等你…因为没东西吃了。熟了之後你也不必管OD的问题… : : 然後再加IPTG(or 或用来induce的药品）以及另外2g Glc.(if using : : stock solution, then it's 10mL 20% (w/v) Glc) : : Let me know, thanks! : 我目前尝试在前面加上signal peptide : 还是看不到有表现orz : 而且..BL21(DE3)本身 : 会有两个蛮粗的band在18.4及25 kDa的地方 : 很容易误会是overexpression的产物 囧 PAGE? 这技术还是需要有一点时间去找到染色、退染的最好时间和ETOH/MEOH 的比率的，over-destain的话，好不容易表现出来的蛋白就看不到了。 当然染不起来也可能是蛋白本身的问题，那麽就要破掉1L的菌纯化才会知道是 不是染不到蛋白的问题了。 --

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