作者vai (for the love of god)
看板Biotech
标题[求救] ligation 接不起来?
时间Sat Jul 28 11:33:30 2007
大家好!
小弟有一问题想问 困扰我好久了T.T
我在clone一段2k 的promoter 序列 想把他接到5k的reporter vector 上
2k这insert先TA cloning 後 有用两边的primer 送过定序了 序列正确
且设计在primer 上两边的cutting site 也都有
然後想要把他接到5k的vector 上时就出现问题了
重做了一个多月 约四, 五 次了 每次接完 transform 抽mini
RE check size 时 理论上要出现我的2k insert 与5k backbone
但每次出现都有"3K" 的 band !! 对 就是3k 每次都有!!!
这几次出现的band 有过" 2k 3k" " 2k 3k 5k" " 2.2k 5k"这三种pattern
5k 跟2.2k(2~2.5k中间@@)的情形中 2.xk的band跟5k的比起来淡很多 有点怪
其它"2k 3k" 或 "2k 3k 5k" 的时後 所有的band 都是一样亮的
本来想说会不会是混到TA cloning中的pGEMT vector( 正好是3k )
但重试了很多次 应该不会每次都切的时後混到吧T.T
然後这些sample 送定序时 发现定回来的1k多序列全部都是我的5k backbone序列
代表完全没有接进insert 那这样子每次都出现的2k又是什麽 3k 又是什麽T.T
快想破头脑了还是搞不懂
希望大哥大姐们能够给小弟指点一点迷津啊 太感谢了!!!
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◆ From: 218.166.111.127
1F：推 lssdai:你要不要用RE 去切vector only(5K那个) ?? 看有什麽情况 07/28 13:03
2F：推 jazzdevil:你insert两端的enzyme site,double digest的效率高吗? 07/28 13:10
3F：推 vai:to一楼 有呀 一开始就是vector两边切完後 跑胶萃取 再ligation 07/28 16:48
4F：→ vai:to二楼 从TA上double digest下来 看起来还好啊 可以切@@?? 07/28 16:49
5F：推 aeroufo:别做TA cloning 用direct cloning别浪费时间在TA clone上 08/01 15:46