谢谢这位版友的回答 看了之後才发现我把实验想得简单了.... 不过有些问题希望可以跟大家讨论一下 : 要注意的是， : 在GST-pull down里面， : 你的A protein和B protein的"量"相较於"正常情况"下， : 其实是呈现overexpress的状态; : 而protein-protein间的interaction是与protein的浓度有关系的， : 在浓度高的时候， : non-specific binding就有可能发生... : 所以A和B或许在in vivo并没有interaction， : 但是在GST-pull down或是yeast-two hybrid的实验中， : 由於他们被"overexpress"了，就发生了平常不会发生的interaction... 关於浓度的问题 我有考虑过 但是在进行GST-pull-down时 利用wash buffer wash的过程中 不知道能不能视为一种dilute 假若可以的话 那麽基本上GST pull-down做出来的结果应该都是可信的 除非 两个protein的大小太过於悬殊 导致可能小蛋白会沉积在大蛋白上造成fale positive : : 但是刚刚利用IP却发现他们之间没有interaction? : 除了实验情境，这里还要考虑到几个问题: : 1. A和B会不会在这个cell里面碰头? : 2. 如果会，那有A的地方一定会有B吗? : 3. A和B在这个cell里面的量有多少? : 4. 有可能很倒楣的，antibody认的epitope刚好在A和B interact的区域。 : 关於问题1，或许A和B有interact的"潜力"， : 但要是A和B在这个cell里面完全不会被表现在同一个区域... : 就算有潜力，终究还是不会发生interaction... 其余恕删 这个问题其实有点怪 因为在进行IP的时候 都会将cell lysis 之後利用cell lysate做IP 如此 假设A与B在cell 里面八竿子打不着 但是不知道为什麽他们在in vitro就是会有interaction 那麽 利用immunoflourence的方法可以知道这两个protein会在不同的位置 但是 用cell lysate的话 因为细胞都被打破了 原本维持两个protein在特定位置的因素就消失了 意思就是几乎等於是in vitro的test 如此所测出来的 应该也是跟GST pull-down的结果一样 (假设两protein expression level 相等 且epitope不在interaction reion) 有些想法 希望跟大家讨论一下XD --

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