其实IP，GST-pull down，yeast-two hybrid作出的结果不一致其实还满常见的， 因为他们三个的实验condition本质上有着满大的不同... ※ 引述《Bluecold (黑特版比就可版好笑)》之铭言： : 各位版友大家好 : 现在我正在进行IP 期待利用A protein 的Ab : 可以将A protein precipitate的同时 : 也将跟他作用的B protein precipitate下来 : A与B protein之前利用GST-B protein与purified A protein : 进行pull-down以後 发现的确是有direct interaction 要注意的是， 在GST-pull down里面， 你的A protein和B protein的"量"相较於"正常情况"下， 其实是呈现overexpress的状态; 而protein-protein间的interaction是与protein的浓度有关系的， 在浓度高的时候， non-specific binding就有可能发生... 所以A和B或许在in vivo并没有interaction， 但是在GST-pull down或是yeast-two hybrid的实验中， 由於他们被"overexpress"了，就发生了平常不会发生的interaction... : 但是刚刚利用IP却发现他们之间没有interaction? 除了实验情境，这里还要考虑到几个问题: 1. A和B会不会在这个cell里面碰头? 2. 如果会，那有A的地方一定会有B吗? 3. A和B在这个cell里面的量有多少? 4. 有可能很倒楣的，antibody认的epitope刚好在A和B interact的区域。 关於问题1，或许A和B有interact的"潜力"， 但要是A和B在这个cell里面完全不会被表现在同一个区域... 就算有潜力，终究还是不会发生interaction... 举个例子，我不是宅在家里就是在实验室做实验， 在这个情况下， 就算有女生喜欢我这型的人， 我要交到女朋友的机率还是微乎其微... 除非我去参加某些活动， 增加我接触其他女生的机率， 就像在GST-pull down中， A和B被强制碰头在一起了... 而2和3则是要一起考虑的问题。 有时IP作不出来， 可能不是A和B没有interaction， 而是因为A和B的量差太多了， 才造成false negative。 为何这样说呢? 举个例子，假设B在cell中的量只有A的1/1000倍... 就算IP A的同时，B也有被Co-IP下来， 但要是你loading在gel上的sample总量是"刚刚好可以看到A的band"的量， 那就就算你的IP sample中同时也有B，但由於B的量差了A 1000倍， 就算有B在gel上也几乎染不到啊~ 另外，就换A和B的量没差那麽多，假设B只少了A10倍好了， 但要是并不是所有B都会和A interact， 比如说只有10% B会和A interact，其他90%的B可能是被送到其他地方做别的事了... 在这样的情况下，会和A interact的B的总量实际上只有A的1/10*1/10 = 1/100， 在这样的情况下，还是很容易出现false negative。 如果是上述的情况， 那你可以考虑增加sample loading的总量， 在增加loading的同时，negative control也要做好， 以免出现false positive。 关於问题4， 要是antibody认的位置刚好是A-B interaction region， 这使的epitope的位置被B挡住， antibody抓不到， 於是只要是和B有interaction的A antibody都抓不下来， 於是只有没和B interact的A才被抓下来， 看起来就是negative结果了。 如果是这种情形，那可以考虑换个antibody， 或是增加IP buffer中的detergent量让antibody binding region暴露出来， (不过相对的A-B interaction也有可能被因被此破坏) : 怪哉 : 不知道版友会怎麽解释这个问题? : 我现在在猜想 : 1. 是否我的lysis buffer中含有太高浓度的detergen(2.5% CHAPS) : 导致干扰了A-B interaction? 我都用0.1% SDS 0.5%NP-40， 还是做的出来; 虽然detergent是有可能破坏protein-protein interaction， 但只是2.5% CHAPS... 如果是够稳固的interaction， 要被2.5% CHAPS破坏应该还满难的... : 2. 我还没wash 光是在cell lysate刚load进去 离心以後就掉了 : 因此我想不会是wash的问题 所以直接想说是binding的条件不对? : 因为我是用PIERCE的seize X protein A immunoprecipitation kit做的 : 接下来会想先降低我的detergen浓度再试一次 : 假如各位版友看到这样的结果 会怎麽解释? --

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