作者pandagreen (未来贝尔)
看板Biotech
标题[问题] 请问有没有使用益生的酵母菌表现系统?
时间Thu May 24 12:15:58 2007
我现在在使用这个系统
我使用的载体是pYLSC1
他是一个外泌型载体
我先将我已经在E.coli表现过的基因片断与载体接合之後
先在E.coli中放大载体的量(这个载体在酵母菌中不会复制)
再使用NotI切一刀 用kit送进酵母菌中
理论上会进行crossing over
再以缺乏Leu的plate来筛
我现在面临的问题是因为它是外泌型载体
蛋白质大部分是分泌在细胞液中
因此在小量表现的部份比较难比较难挑选(外泌的量通常较少?)
另外我们当初为了方便回收有设计一个His tag 在C端
因此在大量表现结束 使用Ni-NTA或 Co-NTA回收
但是却发现一个情况 培养液中似乎有一种物质会将 Ni 离子和 Co离子切掉
(通完washing buffer後 树脂变为白色)
因此就使用硫酸铵沉淀来收蛋白质
请问各位大大有什麽建议或经验吗???
谢谢
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 163.23.34.214
1F：推 wensing:我都是 ph=5 清洗 -> GdnHcl -> 水 -> Ni+2 -> 水 05/24 14:20
2F：→ wensing:-> buffer 这样子的方式recharge重覆使用 05/24 14:23
3F：→ b46006:yeast spent medium容易变很酸 会洗掉Ni 05/24 14:39