请问板上有做过Dual-luciferase reporter assay的先进们 小弟在实验设计上遇到了一个问题，需要大家给点意见 ---前情提要--- 我们想要研究一个gene的promoter 找看看上面的TF binding site是否有function 於是我们就clone许多段deletion constructs 并将这些constructs接上pGL3这个 Luciferase reporter vector 之後将这些reporter constructs 分别与renilla transfect进cell中 此外，为了要看我们所预期的TF是否有作用 也同时co-transfect: pcDNA3、TF-1/pcDNA3、TF-1/pcDNA3 + TF-2/pcDNA3、TF-2/pcDNA3 为了让大家更清楚看懂 大概是这样设计的: No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 renilla + + + + + +　+ + + + + + + + + + pGL3 + + + + Pro-1/pGL3 + + + + Pro-2/pGL3 + + + + pro-3/pGL3 + + + + pcDNA3 + + + + TF-1/pcDN3 + + + + + + + + TF-2/pcDN3 + + + + + +　 + + ---本集重点--- 就这样... 我们照着promega给的protocol分别测出每一组的Luciferase 跟renilla的值 然後我们实验室的算法是将每一组的Renilla值去除以"第一组"的Renilla值 得到一个倍率之後 再将每一组的Luciferase值去除以这个倍率 就等於该组normalized的Luciferase值 再将这个值去除以第一组的luciferase值得到一个fold (Luc. Related activity) 最後我们才将这个fold画成图 只是这样的算法有个很大疑问 Q1: 就是pGL3 本身没有promoter的时候应该不会有Luciferase activity 所以把第一组的luciferase当作分母是否恰当? Q2: 请大家参考一下这篇paper的Fig4 http://www.jbc.org/cgi/content/full/281/43/32140 我们的情况就很像这个实验 只是我研究了很久也不知道他们究竟是以什麽作为normalize的基准? Q3: 大家做这类的functional assay是否会做一组没有transfect的cell lysate 作为一个background值，并且在计算这些data的时候会去扣掉这些background值吗? 简单的说就是要如何normalization拉? orz -- 感谢大家拨冗看完我的疑问 希望有人看得懂我想问什麽 能不吝给我一点点建议与帮助 感激不尽 --

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