※ 引述《content71 (罗莉饲养中...)》之铭言： : ※ 引述《[email protected] (JUAN)》之铭言： : : 照你的描述 最可能就是被破坏掉了 : : 你当然可以加PMSF : : 但我猜效果大概不大 : : 破菌的过程蛋白质被降解的机会很小 : : 另一种可能的办法是 换到Novablue (DE3)表现 : : 也许可以解决 : : 虽然你说有测过 我觉得比较可能的是很多都跑到沉淀物的部份去了 : 先对原PO说声不好意思，借用你的标题 : 因为我也遇到induction的问题急着想找人帮忙 : 我的状况是 : vector : 真核human membrane protein接入pET28a (His-tag) ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ 你有去确认过你的CODON是Ecoli要的吗~~~~~ 如果没有 可能试着做看看Rosseta 要要看 它可以补充 7种 E. coli缺的7种真核的codon 膜蛋白的表现原本就比较少~~~不好拿~~(听说囧) : E. coli strain : BL21(DE3) : BL21(DE3)pLysS : Rosetta(DE3) : induction : E. coli OD600 ~0.4 : 0.5mM, 1mM, for 37度C, 3hr : result --> BL21(DE3) 在induction後就不太生长，SDS-PAGE check无表现 : BL21(DE3)pLysS 在induction後会继续长，但SDS-PAGE check无表现 : western check在uninduce及induce都有表现但很少,leakage? : Rosetta(DE3) transformation後就没出现colonies了 (试过两次) 胜任细胞没做好 : 我自己的推测是 : 此protein对E.coli有强毒性，所以一但induction菌就会挂掉或不生长 : 现在想到的是 1. 降温induction延长时间 : 2. 换Rosetta(DE3)pLysS (但我们老师肯定不会买...太了解他orz) : 3. 换表现菌种 : 4. 大量培养，硬是纯化 (最後的办法，算过大概需3 miligram) induction的浓度跟时间温度 都要抓 我自己遇到的有些三小时就可以 有些要7小时 也看过PAPER 30min就可以的~~~ : 怎麽办阿....我快哭出来了 --

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