※ 引述《[email protected] (VIP好人卡....)》之铭言： > ※ 引述《Talen (找到答案了~)》之铭言： > : 最近正在做表现蛋白质的实验 > : 利用pET30a接入欲表现的蛋白质(约30 KD)後 > : 送入BL21(DE3)中 加入IPTG以诱导表现出蛋白 > : 目前诱导表现情形很顺利 28度C 6小时 > : 在破菌前有取 200 ul 确认过有诱导出来 > : 但问题是每次在破菌後 我要表现的蛋白质会减少很多 > : 不知道是什麽问题? > : 希望各位前辈能提供一些建议　感激不尽～ > : 破菌的方法： > : Sonication　强度为３或４都用过　打十秒　停十秒　共１０分钟 > : French press 使用大 Cell > : 但都依样结果 > 要先问一下你所谓的破菌後蛋白质少很多..是你用那一个fraction去跑胶得到的结果 > 不晓得你有没有测过你的目标蛋白质是soluble form还是inclusion body? > 假设你的蛋白质是inclusion body,而你取上清液去跑胶; > 亦或是你的蛋白质是soluble form,而你取离心後不溶的pellete去跑胶 > 都会得你像你所说的破菌後,蛋白质减少很多的现象 照你的描述 最可能就是被破坏掉了 你当然可以加PMSF 但我猜效果大概不大 破菌的过程蛋白质被降解的机会很小 另一种可能的办法是 换到Novablue (DE3)表现 也许可以解决 虽然你说有测过 我觉得比较可能的是很多都跑到沉淀物的部份去了 -- ※ Origin: 生命科学 BBS <bbs.life.nthu.edu.tw> ◆ From: 61-59-139-151.adsl.static.seed.net.tw