我之前在用New England biolabs的protein G磁珠作IP 刚开始的时候还满顺利的， 有些抗体真能抓到东西， 而且在negative control中(只有sample和bead)， 不会elute出任何东西...... 但是不晓得为什麽， 最近我重复之前的实验， 却不知为何开始出现问题了 囧> 我的negative control中开始出现大量的non-specific binding， 出来的pattern居然还和我的实验组有些类似， 这样我不由地开始有些怀疑之前得到的结果了... 我仔细地翻阅了一遍自己之前的实验记录和data， 老实说我现在的IP作法和之前的IP作法基本上是一样的， 但是我以前的negative control可说是相当乾净， 现在的negative control却相当脏... 真要说作法有什麽不同， 大概也只有我现在是用reuse的bead作preclear(不然太浪费了)， 还有我刚作的时候没有加入PIs(pepstatin A, leupeptin, benzamidine, PMSF) 这些有可能是原因吗? 补充比较细节的部分，我用的IP buffer类似RIPA buffer: 10 mM Na2HPO4, 200 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.1% SDS, 0.5% NP-40, pH 6.3 wash次数为三次，都是用IP buffer进行wash, 基本上wash到第三次就已经 wash 不出什麽东西了.... elution buffer是0.05M diethylamine, 0.5% deoxycholate, pH 11.5. 老实说我都用了这麽强的IP buffer, 居然还会在negative control 看到non-specific binding实在让我很吃惊 <囧> 由於整个实验室就只有我在作这个东西， 老板对於这样的现象也不知道为何会如此， 希望有经验的版友能够分享一下可能的原因.... 谢谢! --

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