请问使用western blot侦测phosphorylated protein kinase时 每次跑出来的结果很不稳定，有时候可以看到磷酸化现象，有时候又看不到 不知道是在那个步骤出了差错？ ============================================================================= 自己觉得可能发生问题的地方 [1] lysis buffer成份 我所用的RIPA buffer为(50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.5mM EDTA, 1mM DTT, 1% NP-40, 0.5% Sodium Deoxycholate,0.1% SDS) 使用前外加 protease inhibitor和phosphotase inhibitor 这个配方是kinase activity assay kit里面里面建议的RIPA配方 但是又有看到有资料上写说进行kinase assay时不可加入Sodium Deoxycholate 不知道是不是我加了什麽不该加的东西呢？ [2] SDS干扰 会不会因为SDS-PAGE里面的SDS把所有蛋白都加上了负电， 如果要看的蛋白分子量太大，多了一个磷酸根跟没有多磷酸根，将无法被分辨 我要看的蛋白是Src kinase(~60kDa)和ERK(~42kDa) 这两种蛋白需要跑non-denature gel吗？ 查paper作磷酸化很多人也是用SDS-PGAE在跑 [3] 温度影响 收完cell lysate後，每100ul加入2.5ul的β-mercaptoethenol，100℃煮10 min 每次要跑胶前再煮100℃ 2 min 这样会boiling过头吗？ 莫非磷酸跟会煮一煮就掉下来吗XD 我是实验室第一个作磷酸化实验的 作了好几个月都一直这样若有似无 不知道一般作磷酸化还有哪些地方是影响结果关键的步骤 想请各位有经验的学长姐提供我可以改善的地方 谢谢各位^^ --

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