※ 引述《killmebaby (不错喔)》之铭言： : 最近做western blotting时,不知到是cell lysate处理的不好,还是怎样,都会抽到DNA, : 造成在跑SDS-PAGE时,都会看到明显的拖带现象.. : 试过离心多次一点,或是lysis buffer加多一点,但好像都没有改善,还是会随机的 : 抽到DNA. : 可以请大家告诉我几个方法吗?快被这一点搞昏了.... : 谢谢大家!! : 我的protocol: : 1.using cold DPBS to collect cell : 2.RIPA lysis buffer(我怕说是不是太强,打破核膜,才会拿到大量的DNA,因为我们 : lab要看细胞膜上的蛋白质,所以lysis buffer要强一点) 有sonication 就不用再去担心有没有打破核膜的问题 还有要看的如果是膜蛋白，应该有比RIPA 更好的配方 RIPA其实是最适合看细胞质内soluble protein的 : 3.加lysis buffer to cell pellet(我大约都加150ul/(3*10)6 cell : 4. vortex 2 minor longer : 5. sonication 5 min 如果你很确定拖带的现象是DNA造成的 那sonication 就是关键 我看过很多sonication 的protocol 都是几分钟... 或多少怎样（视机器）的设定几次的 这实在是非常奇怪的一件事 每次收集到的样本不一样、浓度不同 sonication 要做的份量也就不一样 sonication 真的抓到点，整个振动的感觉都会很不一样 而且不一定会有（通常不会有）很大的噪音 sonication 有没有完全要看你振的过程和结束後solution 的感觉而定 这不是很适合用文字说明... 有人带你作比较容易 真正有做好sonication 的solution，对着光看，在手上晃动几下就可以确认 另外一个band 不够compact 的常见原因是制胶原料的品质 原因可已有很多种可能，而其中最常见的就是常被忽略的APS （我还有看过pH 没调好 or 放太久跑掉的例子，那真是够Orz） -- 年 轻 的 旅 人 之 歌： 真诚的心，洞悉一切隐藏的美 执着的心，在暗地里苦苦思索 勇敢的心，无畏无惧 --

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