※ 引述《killmebaby (不错喔)》之铭言： : 最近做western blotting时,不知到是cell lysate处理的不好,还是怎样,都会抽到DNA, : 造成在跑SDS-PAGE时,都会看到明显的拖带现象.. : 试过离心多次一点,或是lysis buffer加多一点,但好像都没有改善,还是会随机的 : 抽到DNA. : 可以请大家告诉我几个方法吗?快被这一点搞昏了.... : 谢谢大家!! : 我的protocol: : 1.using cold DPBS to collect cell : 2.RIPA lysis buffer(我怕说是不是太强,打破核膜,才会拿到大量的DNA,因为我们 : lab要看细胞膜上的蛋白质,所以lysis buffer要强一点) : 3.加lysis buffer to cell pellet(我大约都加150ul/(3*10)6 cell : 4. vortex 2 minor longer : 5. sonication 5 min : 6. 4度C 离心 13200 rpm or 16100 rcf , 10 min : 7. transfer supernatant(原液) to new microtube : 8. protein定量 (原液在取时有vortex,怕取不准) : 9. 再次将原液离心,4度C 离心 13200 rpm or 16100 rcf , 10 min : 10.搭配lysis buffer将原液稀释到一定量(approximate 80 ug/well),这次原液离心 : 第二次完,取出稀释时,没有vortex : 11.加入sample buffer & DTT, 沸水中煮3 min : 12.煮完後,直接loading : 13.160V, 1hr (此时就看运气了,有时很好,有时就会拖带很明显) : P.S 我想应该不是胶的问题,我是用现成的, Invitrogen NuPage : ..希望大家帮我看看错再哪了..谢谢大家 你这个方法是看total cell protein吧？而你说想看细胞膜的蛋白？ 你应该去买专门抽膜蛋白的kit PIERCE有 也许会贵点，但是你连PAGE都用现成的，我想这KIT对你们应该不会太贵！ 另外，你说会拖？你是不是overloading了？ 因为你都sonication了，DNA大都被你打成小片段了，应该不会造成问题！ 还有sonication稍久了些 --

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