1. 你挑的是蓝的还是白的?. 白的 2. 你的insert 的来源是那里?. 放在 yT&A vector 中的某个基因 我要在他两端加上切位 所以抽plamid 做模板去p 3. 放个没有transform 的 E.coli 再 PCR 一次看看 顺便做一个只放空vector (没有菌) 与你的primer 再做一次 以上简单两个control就能回答你问题 嗯我会试试看 我想请问一下没有 transform 的 E.coli 哪来的阿 它不会长在 LBA 上 所以用 LB 养吗? 这个步骤是为了确认是不是 P 到 chromosome 吗? 4. colony PCR 用 vector 本身的 primer 来 amplify 比较不易出错 其实我做了非常非常多测试 我简单说一下流程好了 我做了两次用自己 pirmer 做 pcr 确认 但定序都没有 所以接下来 1.我一端用M13 一段用 isert 的 primer 做 pcr 有 p 到的送定序 此步骤我有挑蓝色 colony 做 negative control "结果有band 但非预计片段大小" 我不知道怎麽解释 就不管它..... 2.定序结果还是没有..所以我抽送定序的菌的 plasmid 然後我用自己的 primer 去 p plasmid 有预计大小的片段(所以我猜我之前 p 到的应该的确是 plasmid 上的序列) 然後我用re切一刀 (用 vector上只有一个切位 insert 没有切位的re) 发现切完的片段和没有转进任何片段的 vector 是一样长的 所以表示我没有 insert 进任何东西 3.因此我此时怀疑是我 p 到了 vector 上的其他序列 所以我才会换 cloning 的 system 我很蠢 我不知道要怎麽看 primer 和 vector 的序列有无互补 因为可能只有一小段互补 我也不知道是哪一段阿? 4.我最後一次定序 就是用两端 M13 做 colony PCR 结果一样非常诡异 有 p 到两种片段 一种是预计大小的(快1000bp) 但是非常非常淡 另一种很粗很亮 但是不是预计大小的片段 比较小一点(600bp) 比我的insert(850bp)还小 但是又不到没有 insert 那麽小 (200bp) 我把有 p 到 1000bp 的送定序 恩 还是空的 然後我把用M13 P到两种不同片段的菌再用 insert 的 primer p一次 然後通通都有 850bp 的片段 所以我现在正在抽 plasmid 我把 p 到两种片段的菌都抽 plamsmid 明天要来切啦 恩 这就是我现在做的事 不好意思麻烦大家阿 我也想要赶快解决它 ~~ --

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