※ 引述《pan7353 (要变成自己喜欢的模样)》之铭言： : 不好意思 这个问题我其实已经问过一次了 但是还是没有解决 : 我的 insert DNA 有 846bp(PCR 得到的) : 放到 yT&A 的 TA cloning vector 中(用 TA clone 接) : 蓝白筛选了六个 colony 做 PCR 结果都有 specific 的片段(用insert DNA的primer P) : 挑了四个 colony 送定序後 结果四个都没有 insert DNA 的序列 : (用 vector 上的 M13 定序) : 甚至连当初做 colony PCR 的 primer 序列都没有 : 我已经试过的方法 : 1.换 pGEMT system 其他一样 无效(因为我怀疑 colony PCR P 到 vector 上其他序列) : 2.定序结果我有试过互补和反转的序列了 都一样 定序结果只有 vector 序列 : 3.直接抽 plasmid 用RE切 结果显示没有插入任何片段 : 4.把当初 PCR 得到的 insert 片段直接送定序 结果是正确的序列 : 5.另外 我们实验室有三个人做 cloning 都发生一样的情况 就是 colony PCR 有 band : 但定序回来都只剩下 vector 序列 : 抱歉 问题有点长 其实我的重点就是 为何colony PCR 可 P 到 定序却无结果? : 那麽 colony PCR 究竟 P 到了什麽东西勒? 1. 你挑的是蓝的还是白的?. 2. 你的insert 的来源是那里?. 3. 放个没有transform 的 E.coli 再 PCR 一次看看 顺便做一个只放空vector (没有菌) 与你的primer 再做一次 以上简单两个control就能回答你问题 4. colony PCR 用 vector 本身的 primer 来 amplify 比较不易出错 --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 219.68.72.45