※ 引述《icosm (...)》之铭言： : 就是我最近在做一个ligation : size分别为insert 3.4 kb vector 3.3kb : 我用限制脢将vector切开後 再用CIP处理一小时 : 然後就进行ligation 以浓度比insert:vector=3:1来做 : ligation的条件为16度 o/n : 然後以heat-shock进行transform : 再以selection medium的方式涂盘筛选 : 涂盘o/n後 都发现一颗都没长><.... : 表示连self-ligation的结果也没有 : 我已经做了三四次了 结果都是一样 : 但是如果只transform空的vector(没切过的) 就有长出来 : 我真的不知道是那里出了错 : 请教各位前辈给我一些建议~~感谢!! 你的insert太大了 理论上本来就不可能接的起来 一般来说 只要超过vector大小1/3的insert都太大 但也许有高手觉得没差(汗) 在ligation过程中insert跟vector很难去碰撞到并且起反应 我的实验室中 有人做过最大的construct是3k insert接5k vector 但这也是做好久的@@ 如果你一定只能用这个vector 可以试试看 ligation多放个几天 或是在室温下ligation 之前实验室是这样做出来的 你试试看罗~ --

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