今天我做了total DNA extracion from bacteria的实验 照理说最後应该会有DNA沉淀被delute出来 可是我完全看不到沉淀 应该是说明实验失败了(之前学姐带我做的时候有很明显的沉淀) 我实在不知道哪里出问题 希望各位先进不吝指教 首先附上protocol: 1. Inoculate the colony into LB medium,shaking, incubate at 37°C O/N. 2. Centrifuge at 4000 rpm, 10mins, discard the sup. 3. Add 567μl TE buffer, pipetting until resuspended, add 30μl 10% SDS and 15μl proteinase K(20mg/ml), mix, incubate at 37°C at least 1hr. 4. Add 10μl 5M NaCl, mix well, than add 80μl CTAB/NaCl(5% w/v), mix, incubate at 65°C, 10min. 5. Add equal volume of phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1), mix well, centrifuge 4~5 min, put the sup into a new tube, add 0.6~0.8X isopropenol until the DNA precipitate appears. Spin down, discard the sup. 6. Wash the precipitate with 1ml 70% alcohol, centrifuge, discard alcohol, dry the sample at laminar flow, resuspend in TE buffer O/N. 我自己是在以下方面存在不确定的感觉 但是也不知道是否是失败的原因 第一,我最一开始是取了1 ml 的菌液在eppendorf中离心,可是离出来的细菌好像不是很多 即使如此可能影响到实验结果,但应该也不会"一点沉淀也没有吧"? 第二,第五步说到的equal volume,我不知道有没有误解他的意思,我的认知是,假如 我的eppendorf中还剩下五百毫升的液体,我就加入五百毫升的 phenol/chloroform/isoamyl alcohol只是五百毫升中他们三者的比例是 25:24:1,这样有错吗? 第三,同样第五部说到的put the sup into a new tube应该指的是在移到另一管的 上清中加入 isopropenol吧?(这应该不会有错吧) 因为没有沉淀出现 我想应该是彻底失败了 当然每一个步骤都会影响实验的结果 只是我无法很犀利的找出问题的所在 因此很感谢大家的帮忙 再不然最坏的可能性 就是当初配药的时候有问题= = 谢谢大家的帮忙 --

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