作者freesoul (寻找生命的出口)
看板Biotech
标题Re: [问题] RNAi knock down
时间Sat Mar 31 10:49:22 2007
※ 引述《ad1980 (Apoptosis)》之铭言：
: 不好意思，又是我，本来要跟上面那篇一起的，
: 可是问题好像不太一样，所以开新的一篇。
: 还有一个问题想请教大家，
: 现在在做 knock-down, 用 pSuper，
: 想请问一下，要多久才能看到knock down 阿？
: 24 hrs 会太短嘛？我看papers 都是3-5 days,
: 但是我想问说通常transfection後，大概多久之後会开始knock-down。
: 还有，我现在做是用immunostaining，然後再用ImageJ量signal intensity，
: 看看有没有减少，不过这样感觉好像少了什麽。
: 除了Western blot之外还有其它方法知道到底有没有成功knock-down 嘛？
: 因为我做RNAi主要是想确定我的Ab 是对的，是specific to my protein，
: 如果intensity 有减少代表Ab没错，问题是Ab要很concentrate才能在WB显现，
: 做WB的话会用掉很多很多Ab....
: 不知道大家通常是怎麽确定有没有knock down 成功。
: 感谢。
RNAi knockdown要看你的protein half life
所以一些cell cycle相关的可能两三天效果就出来了
运气不好做到那种turnover很慢的可能四五天还是看不出来有什麽差
所以三四天是我觉得(假设)什麽都不知道下第一个可以试着抓的时间点
另外用RNAi来确定你Ab的specificity
除非你很确定这个RNAi sequence是真的有用 比如已经是published的
用一个不确定的东西来证明另一个不确定的东西我想不是一个很好的办法
还有WB需要的Ab量应该比immunostaing少吧?
真的很暗很暗就曝光O/N 再怎样应该都还是比做immunostaing省Ab说
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 141.214.17.17
1F：→ ad1980:RNAi 其他实验室用RT-PCR试过了，有用，所以我们拿来试 04/01 10:30
2F：→ ad1980:蛋白质，看有没有被抑制，希望证明我们的Ab是对的。 04/01 10:31
3F：→ ad1980:不过，如果不用RNAi，还有什麽方法可以证明Ab是对的阿？ 04/01 10:32
4F：→ ad1980:一个刚开始被研究的蛋白质，没有Ab，所以自己做了Ab的话， 04/01 10:33
5F：→ ad1980:除了RNAi，还有其他方法可以证明自己做的Ab是对的嘛？ 04/01 10:34
6F：→ ad1980:自己先做RNAi，然後用RT-PCR证明有用後，再拿来证明Ab？ 04/01 10:36
7F：→ ad1980:嗯，我会看看能不能试WB，感谢解答。^_____^ 04/01 10:37