如果ligation後，transfermation 到 jm109或其他保菌的e.coli 你涂满满个plate後，隔天长出来的，一颗一颗的，你可以做colony PCR或养O/N 隔天用酵素切，如果有的话 那个颗菌还不能叫做是single colony 你必需要把他确定有INSERT的COLONY挑一颗之後，再画plate，画成三重覆 隔天再长的单一菌落 再吊他养O/N後，抽plasmid去切酵素看看 如果也是有，这才能确保你的菌只有这个一很纯的plasmid 你再抽他的plasmid，再transfermation到会表现的细菌 一样涂满再长，隔天会有一颗一颗的菌，你在这就可以直接挑 因为你的plasmid很纯，不会有fusion protein only的plasmid在里面 这样你了解我的意思吗? 因为我们之前送定序的结果，常常有杂band 所以老师之後要求我们做三重覆的colony 做了以後，品质会比较好 你可以试试看，但只是参考 ※ 引述《churchfire (别小看我...)》之铭言： : 我在做GST-fusion protein的时候 : 我一开始养小量的试IPTG&温度&时间 : 後来我在试时间的时候，IPGT浓度固定在0.4mM 温度25度 : 0、3、6、9小时都收，在跑PAGE的时候其实看不怎麽出来我的蛋白有没有大量表现 : 我的蛋白(26KD)加上GST(26KD)大约为52KD : 反观GST在26KD的位置都有表现! : 同样的条件去做western : 只有3hr的菌有看到微弱fusion protein的band 并有明显的GST only的band : 请问这样的话要怎麽解决呢?因为我後续要做GST pull down看interaction! : 大家有遇过这样的问题吗?我的蛋白推测是transcription factor : 会不会在产生的过程中，就回去bind在DNA上作用掉了? : ---------------------------------------------------------------------- : 同样的我养1L的菌，IPTG 0.4mM 25度 6hr : 用GST˙Bind Kits(GST˙bind resin)来纯化我的fusion protein : 收下来的 做western, 同样是微弱的fusion protein的band : 还有很明显的GST only的band : 这样的话,那我要如何才可以提高我的fusion protein?降低GST protein? : 希望各位学长姐可以给我点启蒙!! : 谢谢 --

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