作者churchfire (别小看我...)
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标题Re: [问题]GST fusion protein的问题
时间Thu Apr 13 15:40:55 2006
我在做GST-fusion protein的时候
我一开始养小量的试IPTG&温度&时间
後来我在试时间的时候，IPGT浓度固定在0.4mM 温度25度
0、3、6、9小时都收，在跑PAGE的时候其实看不怎麽出来我的蛋白有没有大量表现
我的蛋白(26KD)加上GST(26KD)大约为52KD
反观GST在26KD的位置都有表现!
同样的条件去做western
只有3hr的菌有看到微弱fusion protein的band 并有明显的GST only的band
请问这样的话要怎麽解决呢?因为我後续要做GST pull down看interaction!
大家有遇过这样的问题吗?我的蛋白推测是transcription factor
会不会在产生的过程中，就回去bind在DNA上作用掉了?
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同样的我养1L的菌，IPTG 0.4mM 25度 6hr
用GST˙Bind Kits(GST˙bind resin)来纯化我的fusion protein
收下来的 做western, 同样是微弱的fusion protein的band
还有很明显的GST only的band
这样的话,那我要如何才可以提高我的fusion protein?降低GST protein?
希望各位学长姐可以给我点启蒙!!
谢谢
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.82.244
1F：推 cloud74115:有检查过reading frame吗? 接的地方看有没有跳位 04/13 21:02
2F：推 churchfire:检查过了！序列没有问题！ 04/13 23:08
3F：推 dorphilvet:为什麽一开始就用25度养?是37度的养不出来吗?? 04/13 23:10
4F：推 churchfire:因为37度诱导表现的没有25度好！所以我用25度诱导 04/14 22:54
5F：推 dorphilvet:那你一开始有挑单一菌落再去画成三重覆吗? 04/16 01:17
6F：推 churchfire:哪时候要画single colony?我将我的plasmid转入BL21表现 04/17 20:42
7F：→ churchfire:蛋白质，plate上面的菌我挑四颗来表现,养菌!养大量的话 04/17 20:44
8F：→ churchfire:我就挖菌保直接养! 04/17 20:45
9F：推 dorphilvet:transformation到JM109或DH5a的时後，那时如果有画 04/17 22:51
10F：→ dorphilvet:到bl21就可以不用再画single colony 04/17 22:52
11F：推 churchfire:当时transformation是直接拿菌液涂plate!所以长出一颗 04/18 10:33
12F：→ churchfire:一颗的single colony!您的意思是这样吗?你也有类似的经 04/18 10:36
13F：→ churchfire:验吗?谢谢! 04/18 10:36