作者dorphilvet ( )
看板Biotech
标题Re: 请问各位有没有好用的抽nuclear extract的土法呢?
时间Wed Mar 29 05:45:50 2006
Solution A ( 20mM Hepes pH7.5, 5mM KCl, 0.5mM MgCl2, 0.5mM DTT,
0.2mM sucrose )
Solution B ( 20mM Hepes pH7.5, 5mM KCl, 0.5mM MgCl2, 0.5mM DTT,
1mM PMSF )
Solution C ( 20mM Hepes pH7.5, 0.5mM MgCl2, 0.5mM DTT, 1mM PMSF
0.25mM sucrose )
Solution D ( 20mM Hepes pH7.5, 0.5mM MgCl2, 0.5mM DTT, 1mM PMSF
0.6mM sucrose )
Solution E ( 50mM Hepes pH7.5, 10% sucrose )
细胞超过108 将其消化以PBS清洗细胞，离心1000 rpm 5min
-->去上清液
加入15ml sol.A 悬浮细胞，离心1000 rpm 5min, 共三次
-->去上清液
细胞悬浮於4ml sol. B中，置於冰上10min，用pestle B 反覆研磨，置於显微镜下观察，
直到视野中为细胞核，离心1000 rpm 5min
->去上清液
将pellet 悬浮於6ml sol.C中，并将其加至6ml sol.D中，离心3000 rpm 30min
-->去上清液
将pellet悬浮於1ml sol.E中，计算细胞数，并加入sample buffer
protocol大约是这样
但我不能确定有没有抽到细胞质的蛋白
※ 引述《aggaci (有气质的台客)》之铭言：
: ※ 引述《dorphilvet ( )》之铭言：
: : 我是用不同浓度的醣让细胞涨破，抽核蛋白
: : 我没有用过kit，因为我们也是抽大量的
: : 但因为没有比较过，所以不知道好不好用
: : 但比整个细胞加sample buffer下去煮还要好就是了
: : 比较乾净
: 谢谢你
: 但是能否请教一下你们的protocol的步骤?
: 还有抽出来的蛋白会污染到细胞质的蛋白吗
: 感谢
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◆ From: 61.64.162.223
1F：推 liuse:染个tubulin来看应该就可以知道分的好不好吧 03/30 13:11