作者dreamcity (飞行在宇宙中的航海者号)
看板Biotech
标题Re: [问题] 关於Clone的问题.
时间Tue Feb 28 09:40:01 2006
※ 引述《intotheman (花草盒子)》之铭言：
: ※ 引述《dreamcity (飞行在宇宙中的航海者号)》之铭言：
: : 各位好,小的是一个小硕一,
: : 我有两个基因片段要clone起来做定序,
: : 但是这两个都不太小,一个2.8K,另一个3K.
: : 我用实验室里的cloning Kit试过好几次了,一直失败.
: : 老师也一直说不要乱做浪费钱(他X的我完全照protocol.....)
: : 请问各位有什麽好方法帮帮我吧!!
: : 另外再请教,做完transformation後把plate放O/N,
: : 隔天看plate上满满的都是菌落,代表什麽意思?
: : 要一个一个挑起来筛选吗?
: : PS:
: : Cloning system:
: : 1. GeneMark pOSI-T Cloning Kit, 用的是Kit附的胜任细胞.
: : 2. TOPO TA Cloning Kit(PCR-II cloning vector), 用的是实验室的胜任细胞(DH5α)
: sorry 你说的要先clone定序，是说只要订这两个片段吗?
是的
: 如果是的话，直接用rtTH做PCR片段，再用Topo做蓝白筛选，再用vector上的primer去定序
: 不过接近3K大小的片段，不好送进vector里面，记得要将transformation完的
: 菌液离下来全涂到盘上(IPTG/X-Gal)再挑白色的起来check吧
: 如果是要做subcloning接上去的话,请爱用gel-extration kit确保DNA片段的清洁
请问subcloning是指用degenerate primer做PCR後,切下所要的片段大小的gel,
经过gel elution後做cloning吗?
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◆ From: 140.120.149.12
1F：推 intotheman:对的 确保clone片段够清洁 02/28 20:10
2F：推 dreamcity:我就是这样做的....gel elution时TAE乾净与否有关系吗? 03/03 13:23