※ 引述《timbrian (perk yourself up)》之铭言： : ※ 引述《[email protected] (死胖子超怕热)》之铭言： : : 将domain A与fish的gene做fusion : : 将domain B与bait的gene做fusion : : 然後将domain A-fish的部分先做modofication : : 再将domain A-fish-M混在domain B-biat混和 : : 观察有M和没M的结果是否有差异...... : : 只是这样透过一个中间物不知是否会对您的实验需求有影响就是 : : 看起来像yeast two hybrid XDDDDD : : 不然就...利用chemical reagent做partial modification吧 : : 控制chemical的浓度、反应pH、buffer,etc... : : 印象中Cyanylation测disulfide bond的方式也是partial modification ^^" : : (最近千面人很热阿...XDDDD) : 讲仔细一点我们的构想 : 我们想研究一个蛋白质两个 domain 的互相影响 : 目前这个蛋白质已经有结构 (X ray) : 我们想看这两个 domain 在动态下的结构改变 : 尤其是看其两个 domain 如何细微的藉由结构的改变而调控彼此 : 两个 domain 分别为 15 kDa 与 30 kDa : 其中 15 KDa 的部份想用 N15 做 labelling : 而 30 kDa 的部分不没有 labelling : 分别纯化出来 看能不能再结合为 full length protein : 再以 NMR HSQC 的方式只看其 15 kDa 的部份的结构改变 : 这个实验设计为最大的盲点就在如何使两个 domain 再结合回去 : 已知这两个domain 中间有一个 linker 的部位 : 但是如何能专一性的将这两个 domain 的 N端 与 C端接在一起就是个大挑战 : 因此 fusion 的办法似乎是不可行 : 所以在想有没有其他方式可以结合这两者 : DNA 具有 DNA ligase 可以结合 DNA 的 3' 与 5' : 蛋白质好像就没听说过可以有 enzyme 结合 N 端与 C 端 : ubiquitin 结合的机制好像也不适用 : 化学 cross link 的方法会卡在蛋白质表面胺基酸的 side chain : 也会任意的键结在一起 : 有没有知道其他方式可以做的阿 : 还是这本身就是个很难的题目?... 嗯 那如果这样呢 把两个蛋白质的C-ter与N-ter接上一小段nucleotide 然後再用DNA ligase接起来.... 不然就把23S rRNA的 aminoacyl-transferase活性拿出来用 如果可以的话 否则就分别分开两个domain做labelling 然後用化学合成peptide的方式 把两个domain以一级结构的方式合成 再筛选 不然在两个domian的C-ter与N-ter各接上DNA/RNA 以及DNA/RNA binding domain然後丢在一起 好吧 我承认我是来乱的 可是这是我认真想出来的 --

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