※ 引述《[email protected] (死胖子超怕热)》之铭言： : ※ 引述《[email protected] (perk yourself up)》之铭言： : : 因为想研究一个蛋白质的某个domain 的 modification : : 如何影响到另一个domain 的活性 : : 却又不想使两个domain 同时被 modify (两个domain 都有modify 的位置) : : 而使用一般的chemical cross linker 会 nonspecific modification : : 其结合方式会不正确 结合方式与 native 的方式会不同 : : 请问板上诸大 : : 有没有看过任何方法 : : 可以将两个不同的蛋白质接在一起 : : 而非是经由 cloning 的方式 : : 且接在一起的方式分别为两个蛋白质的N端跟C端的结合 : 将domain A与fish的gene做fusion : 将domain B与bait的gene做fusion : 然後将domain A-fish的部分先做modofication : 再将domain A-fish-M混在domain B-biat混和 : 观察有M和没M的结果是否有差异...... : 只是这样透过一个中间物不知是否会对您的实验需求有影响就是 : 看起来像yeast two hybrid XDDDDD : 不然就...利用chemical reagent做partial modification吧 : 控制chemical的浓度、反应pH、buffer,etc... : 印象中Cyanylation测disulfide bond的方式也是partial modification ^^" : (最近千面人很热阿...XDDDD) 讲仔细一点我们的构想 我们想研究一个蛋白质两个 domain 的互相影响 目前这个蛋白质已经有结构 (X ray) 我们想看这两个 domain 在动态下的结构改变 尤其是看其两个 domain 如何细微的藉由结构的改变而调控彼此 两个 domain 分别为 15 kDa 与 30 kDa 其中 15 KDa 的部份想用 N15 做 labelling 而 30 kDa 的部分不没有 labelling 分别纯化出来 看能不能再结合为 full length protein 再以 NMR HSQC 的方式只看其 15 kDa 的部份的结构改变 这个实验设计为最大的盲点就在如何使两个 domain 再结合回去 已知这两个domain 中间有一个 linker 的部位 但是如何能专一性的将这两个 domain 的 N端 与 C端接在一起就是个大挑战 因此 fusion 的办法似乎是不可行 所以在想有没有其他方式可以结合这两者 DNA 具有 DNA ligase 可以结合 DNA 的 3' 与 5' 蛋白质好像就没听说过可以有 enzyme 结合 N 端与 C 端 ubiquitin 结合的机制好像也不适用 化学 cross link 的方法会卡在蛋白质表面胺基酸的 side chain 也会任意的键结在一起 有没有知道其他方式可以做的阿 还是这本身就是个很难的题目?... --

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