※ 引述《[email protected] (C'est)》之铭言： : ※ 引述《[email protected] (遥远的未来)》之铭言： : > 方便请问你详细的步骤吗? : > 我现在也在做plaque assay : > 可是 都做不出来 :( : > 实验室以前没人做过 : > 我查到的有用neutral red染色 也有用结晶紫染色的 : > 我现在用neutral red去染 不过都没有结果 : > 不知道是哪个步骤出了问题 : 我们实验室也是用结晶紫 : 你可以把你作plaque assay步骤说出来给大家听 : 这样我们也好提供意见给你 我上次做是fallow我找到的一篇论文 用6 well去做，cell先在6well中养一天， 隔天加入不同倍数的病毒稀释液，37C感染两小时之後用PBS wash 三次。 然後加入含1% agarose,1ul/ml trypsin的medium 2ml perwell， (用2%的agarose跟2倍浓度的medium做1:1稀释)。然後37度C倒置培养三天。 再加入1% agarose 跟0.1%neutral red 的PBS 0.5ml per well，37C 五小时之後观察。 (这当中medium 加2ml是我自己试的，因为paper上没写该加多少 後面加0.5ml也是） 之後我有问到另一个protocol 不过因为不是很确定这当中的步骤 所以还没有做 另一个protocol如下： （以下的步骤不是我写的，请不要引用，谢谢） 1.病毒以汉克缓冲液 (Hank's solution) 做十倍连续稀释，由10-1稀释至10-7。 2.把单层细胞的上清液吸掉後，加上病毒稀释液0.05 ml，每一稀释液接种二个洞(well) 并放置在37 ℃温箱一小时，其间每十五分钟摇动一次，使病毒可充分与细胞接触。 3.二倍的Eagles液与二倍高级琼脂等量混合，即成一倍的工作液，(Eagles 培养液放在 37 ℃水箱半小时) ，此时温度约为41℃，每一洞内加0.5ml。 4.放37 ℃温箱培养，并含二氧化碳2.5 %。 5.48～96小时，显微镜观察有CPE时，以10% 福马林固定液一滴加於一个洞中，过夜。 6.固定後之微量盘置於水龙头下，以水冲掉琼脂，倒放，使水份流乾。 7.以1 % 结晶紫染液二滴染色一分钟，再以自来水冲洗染液，直至无染料洗出为止。 8.自然乾燥後，便显出无色的不规则空洞。 我看不懂的是5～6的部分 步骤5，10%福马林加下去之後，agar会溶掉吗？还是会渗进去？ 这时候应该是要放回37度C吧？ 那要倒放还是正放？ 步骤6是我最困惑的地方，用水把agar冲掉，cell不会因此跟着被冲掉吗？ 另外就是，这些含有病毒的东西，冲到水槽去会不会怎样？ 请有经验的人帮我解答一下好吗？ 谢谢！ 这个实验我实在是从来没做过，实验室也没有其他人在做 一切都是我用想像的然後去试试看 --

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