※ 引述《aggaci (五子棋啦)》之铭言： : ※ 引述《[email protected] (wait till die)》之铭言： : : 那就不要用silver stain了.... : : 又丑又难控制染色的条件 : : 同一片gel我自己都不太敢确定 : : 是不是某块地方染的比较久才比较深 : 我没办法ㄝ : 因为细胞没办法收那麽多 : 而又做TCA沉淀会损失一定的蛋白质 : 所以只能用银染 : 至於SYPRO RUBY我门没有萤光scanner... : 所以没办法用~ 我之前花了大概一年的时间在抓2D的条件 我不是高手啦 只能说在错误中学习 它真的是个机车的实验 我想 我应该可以分享一点点小小的心得吧 1. total cell lysate 本来就很容易有一大堆杂七杂八的蛋白质 如果是因为你的lysis buffer盐类含量太高而影响2D分析效果 进而要用TCA沉淀置换buffer 那势必会lost许多蛋白质 我有个小小拙见 millipore叫做centricon的离心管 根据你的需要有不同的大小及容量 轻易的置换buffer 或者 直接利用2D专用的lysis buffer萃取蛋白质 2. silver stain很容易因为stop的时间不同而染过头 当蛋白质量太多的时候 敏感的silver stain也会过度的侦测 通常会建议Ruby stain 但是如果没有机器可以操作 silver stain可能还是要再多练练累积经验才行 3. BCA kit侦测蛋白质量准确度有限 如果你要很精确的定量 倒不如用稀释不同浓度的BSA跑SDS-PAGE 用内插法的方式定量 说不定会比BCA kit更准确 4. 胶片上之所以会有直线及横线的产生 最主要可能有几个原因 横线的产生是因为 1D电压因为lysis buffer中内含物产生电阻 使电压未到达既定的电压数 或是program完成或duration time过长所导致 原本到达定位的蛋白质 可能因为你的延迟时间太长而移位 直线的产生 可能是因为2D给予电压过大 蛋白质还没有在定点停住 就被强制向下推进 5. 胶片上会有一团团蛋白质点出现 排除可能是因为染过头 或是蛋白质量loading太多 还有一个可能 就是你所分析的蛋白质多坐落在那个分析范围内 如果你对那边的蛋白质很有兴趣 建议你缩小1D及2D的条件 应该可以看到很明显的差异 6. 两片胶是不是真的具有差异 除了眼睛肉眼上的判断 这是在loading量相当 背景值类似的条件下 肉眼判断才有意义 在2D上还有一种软体叫"ImageMaster" 可以透过圈选蛋白质点 扣除背景值 选择internal standard 计算出两片胶上相同两个点相对倍数关系 Trouble-shooting可以上amersham网站上看 应该可以解答你很多疑问才对 http://www.amershambiosciences.com 希望我这一点点小小拙见 对你的实验会有帮助 祝你好运 我觉得做2D是一条不归路 还是我太差劲了 Orz...... -- 找到一个会逗我笑的人 感冒快快好 要照顾好自己喔 --

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