※ 引述《oplz (oplz)》之铭言： : 我是门外汉..这几天看了一堆 structural biology 的 articles.. : 感觉有点消化不良.. 看到难得有专家在这 赶紧问些问题! : 1. crystal biology 里面的结晶多是在细胞内不存在的情况下结晶而成 : 要怎麽确定 in vitro 结出来的就和 cell 内的 protein structure 是一样的? : 也就是我们怎麽知道解出来结构真的出现在细胞内? : 以 prion 为例, 一种 protein 确有可能有两种以上的结构 : 我们怎麽知道我们拿到的稳定结构是对的那一个? : 如果确有可能拿到错的结构 机率有多大? : 能拿到结晶的 protein 里面有几成是可信为真的? 刚刚有点仓促，打的很乱，不知道看不看的懂 基本上就如前一位版友说的，要去确定protein的结构在in vivo和in vitro 是否相同，以目前的技术来说是不可能的，不过我们可以根据该protein在in vivo 的enviroment，去决定在长晶时要添加什麽去帮助其结晶， 举例来说，一个ATPase，通常我们可能加入ADP、ATPγS、镁离子，等去帮助其结晶， 对某些protein来说，可以发现有添加的会长，而未添加的可能不会长或是长的很不好， 另外，譬如一些membrane protein，通常都很难长晶，有些人会添加一些 类似膜的LIPID分子去帮助其长晶，当然还有很多状况， 根据不同的protein，我们可以设计要以什麽样的condition来长晶， 这边还是要强调，要在一个温和稳定的环境下，有稳定的结构， protein才有机会长出晶体，当然还是会有一些特殊状况， 可能需要将protein放在4℃或是叫高温的环境去长， 另外加入一些substrate去长晶也是一个方法，譬如DNA binding protein 就加入DNA去长，长出晶体以後，解出结构，看看protein结构里看不看得到DNA 另一方面也可以根据已知的funtion来跟得到的结构互相验证，判断其可信度 有太多的学问，总归一句结晶是一门艺术， 有些时候还真的不能用哪些规则去度量 : 2. MS strategy 里面, 可以知道 aa 的相对位置..但距离怎麽算? : 又用不同 chemical ragent 处理 会不会改变构型? : 3. 有人说总有一天 protein structure 可以用电脑完全模拟出来 : 也就是说 protein folding 确实有一套依循的原理存在 : 只要找到这个公式 就可解决问题, 你的想法? : 4. structural biology 的重要性在哪里? 将来发展还剩下的空间跟扮演的角色? : 前景如何? (如果有人觉得这是问前途 不理它亦可..) : 5. 你在袁小琀的lab 吗? :) : ※ 引述《littlesky (littlesky)》之铭言： : : 介绍一下小弟最近在进行的一项研究 : : 结构生物学为目前生化研究上的一门显学 : : 但台湾在这方面起步较为晚 : : 故慢世界潮流有一段时间 : : 目前在台湾在结构生物学上的发展 : : 除了中兴 其他几乎集中於新竹以北 : : 其中仪器与技术将是目前结构生物学绝对的关键 : : 以目前研究蛋白质结构的两大主流 : : crystallization and X ray diffraction : : 与 NMR 而言 : : 以 x ray diffraction 在解结构而言 关键常在crystallization : : proetin crystallization 筛条件耗时耗工 : : 在某方面而言 也相当耗钱 : : 目前除中研院生化所具有robot 可以大量节省筛条件的时间 : : 其他的少有实验室有资本人力来作 : : 其另一重点为 x-ray diffraction 由於历史悠久 : : 几乎很多好找条件的protein (soluble , 稳定, 表现量大....等等等) : : 早已被解完 : : 现今的挑战常在於一些 membrane protein, unstable protein... : : 由於 crystallization 所需 protein 量也大 , 更加深一些困难度 : : 就 NMR 而言 : : 目前高解析度的仪器极少 (台湾 800 Mz 才两台) : : 且 protein 有一些size 的限制.. : : 在讯号的分析上 也是相当的耗时耗工 : : 故科学家在这两方之外 又尝试了一些方法来进行蛋白质结构的解析 : : EM (electro microscopy) and MS : : 利用 MS 解结构 好处是其为 high throughput : : 与入门的条件较低 : : 其方法是将蛋白质进行利用特殊的化学试剂 : : 进行化学交连法 (chemical crosslinking) : : 此化学试剂可以专一性的将蛋白质特定的胺基酸以共价键结合 : : 处理完之後的蛋白质利用专一性的蛋白腜或是化学试剂将蛋白质水解 : : 再以质谱分析其片段 将哪个几号位置上的胺基酸与第几号位置上的胺基酸交连 : : 就可以将蛋白质特定胺基酸的空间位置预测出来 : : 不同的种类 长度的 cross linker 可以进行不同胺基酸的反应 以增加可信度 : : 利用胺基酸的空间位置 配合上 atomic modelling... : : 利用蛋白质二级结构的概念 (如热力学 立障效应) : : 即可极为初步的看出蛋白质三级 甚至四级结构 : : 有人可能会 complain 这仍旧是有电脑预测 : : 但在二级结构上 加入了 CD 的数据.. : : 三级甚至四级结构上 加入了EM 的数据 : : 在拥有大量的实验数据佐证上 突破以往 x-ray 与 NMR 的 strategy 就产生了 : : 其优势在於他不像 x-ray 需要有结晶, NMR 受到解析度与size的限制 : : 而且他需要量极少 不像 x-ray 与 NMR 所需蛋白质量较高 : : 仪器上 LC-MS MS 与极高能量的 x-ray 光源, 超高解析度NMR动则上亿比起来 : : 也是好的多 : : 故从 2000 年开始 以质谱进行一些重要的蛋白质结构的解析越来越多LAB参与 : : 相关质谱应用於蛋白质 3D 结构上的软体也被发展出来 : : 在 2003~2004 相关的 paper 突然暴增 : : 我在前一年碰 protein crystallization 後 再有了single crystal後 : : 转向研究 protein topology 上来 才进入这项实验 : : 目前除了我在中研院所接触的lab以外 还没听说过台湾的实验室有人开始进行 : : 所以我有问题都得 e mail 去请教外国的专家.... : : 相关 reference : : Chemical cross-linking and mass spectrometry for mapping three-dimensional : : structures of proteins and protein complexes. : : J Mass Spectrom. 2003 Dec;38(12):1225-37. : : Chemical cross-linking and mass spectrometry for protein structural modeling. : : J Mol Biol. 2003 Aug 8;331(2):303-13. Review. : : 以上为介绍相当好的两篇 : : A top-down approach to protein structure studies using chemical cross-linking : : and Fourier transform mass spectrometry. : : Eur J Mass Spectrom (Chichester, Eng). 2003;9(6):623-31 : : Probing three-dimensional structure of bovine serum albumin by chemical : : cross-linking and mass spectrometry. : : J Am Soc Mass Spectrom. 2004 Aug;15(8):1237-47 : : Mapping the topology and determination of a low-resolution three-dimensional : : structure of the calmodulin-melittin complex by chemical cross-linking and high-resolution FTICRMS: direct demonstration of multiple binding modes. : : Biochemistry. 2004 Apr 27;43(16):4703-15. : : ....... --

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