先暂做简介,以後有空在上来po详细方法: Tap-tagging全名为Tandem Affinity Expression Purification, 一种很有效率的纯化方法,顺便可以钓出protein complex, 对於未知与其他蛋白作用的特定蛋白,这是个好方法, 而且纯化出来的蛋白纯~ 策略为: 1.在Target protein的C-terminal加上CBP(calmodulin binding protein), 再来是TEV site(可被TEV protease切断),再来是protein A三个Tag的fusion protein, 用PCR放大此片段後(两边要有Target gene的部分片段做recombinent,有一种特殊的 plasmid叫pBS1479与pBS1539专门做这种方法),transform入yeast(我用Saccharomyces Cerevisiae modified strain)。 2.筛出菌後养大破菌,以超高速离心(不同蛋白不同条件)後取上清,跑含IgG的column,其 目的为和Target protein最尾端的protein A结合,流洗完後拿TEV protease下column ,这时会发生什麽事大家很清楚,出来的液体只有Target protein和TEV protease与 少部分non-specific protein。(由於protein A和IgG结合力非常强) 3.再拿此流洗液下第二道column,含Calmodulin beads(内含Ca2+离子),这时大家也知道 会发生什麽事,就只有含calmodulin binding protein的Target protein会binding 上column,再用Native elution即可。 出来的蛋白很纯而且不破坏蛋白在cell里和其他protein interaction的结果, 这个方法之前都是free的,网路上可以察到全部的方法,前阵子又要用时才发现 设计的人跑去开生技公司,然後这个方法变成一套产品。 下面的网站有详细的做法,有兴趣的就参考看看罗! http://www-db.embl-heidelberg.de/jss/servlet/de.embl.bk.wwwTools.GroupLeftEMBL/ExternalInfo/seraphin/TAPtagging.html ※ 引述《HIbaby (嗨北鼻)》之铭言： : 我都用ip啦 同实验室的学长 有人用GST 有人用yeast two hybrid : 不过我不知道 你说的物化方法是哪些 可以举个例吗 : 印象中 有用生物赶测器的方式 来测蛋白质和受体间的结合力 : 当结合以後 会有微电极产生 : 可以比较精确测得binding的强弱 : 这算物化法吗? 如果你有兴趣 我再找相关paper给你看 : ※ 引述《baseguard (....NN )》之铭言： : : 各位在做研究时,测试protein-protein interaction 大概都是用什麽方法? : : yeast two-hybrid, GST(or orther tags) pull-down ,IP ... : : 这些我都用过...带给我很大的困扰..各有各的麻烦 : : 似乎有人用比较物化的方式,可不可以分享看看? : : FRET? : : isothermal titration ? : : 因为本身都是用分生的做法 : : 希望一窥物化　生化领域的朋友的观点 --

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