※ 引述《hurp (LentiVirus)》之铭言： : ※ 引述《ginmol (储备博士)》之铭言： : : 我有几个有关western blot的问题想请教各位先进： : : 1. 一级抗体的稀释溶液何种较佳？可使其能够保存重复使用？ : 以Santa Cruz p53 DO-1 antibody为例, 我将ab 1:3000 泡在 1X TBST : with 0.05% Sodium Azide, 可加 4%奶粉. 存放及使用都是在4度C. 这一管东西, : 我平均一个礼拜用一次以上, 回收再用. 再没有补加ab的情况下, : 目前已经迈向第三个月了. 效果依旧很利. : 要注意的是一抗跟二抗之间的wash要充分, 例如 1X TBST 15 min X 4 time. : 把Sodium Azide 充份洗去, 因为这东西好像会影响二抗HRP的活性. 一般来说脱脂牛奶不建议长时间重复使用 （也不是一定不行 就是不建议） 要重复使用的可以用 BSA + NGS 另外，HRP 的确不能碰 Sodium Azide 不过正常的 western 步骤应该都可以有效去除掉 1st Ab 中的 azide : : 2. 是否曾尝试以微量反应体积覆盖membrane的方式进行抗体抗原反应？ : 我是用小塑胶袋封装membrane, 以mini gel的面积来说, 大约6~8 ml的 ab溶液. 小袋封装可以作到 1-2 mL 吧 : 我同学是把membrane 装进 50 ml试管, 也是加 6~8 ml的溶液. 放入摩天轮去转 : : 3. 一般蛋白loading量约多少较为适当？ : mini-gel, 7.5 mm 厚. 我一般loading从 20 ~ 60 ug, 取决於你想看的protein本身 ^^? : 的量多不多. 这种事情真的很难讲 以细胞的 lysate 为例，我的习惯是如果不知道适当浓度的话 先 load 一个 10cm dish 中的 1/100 看看 : : 4. AP与HRP系统，何者的讯号强度较高？ : 我个人偏好HRP, 虽然较不方便, 但讯息比较敏锐. 如果你用好一点的ECL kit, : 讯号会很强. Millipore (作超纯水机 滤膜 PVDF 那家) 也有推自己家的 substrate 号称好处是价钱便宜 敏感度又非常高 所以可以用更少的二抗 实际用起来的感觉 敏感度真的是高 可是未必是好事 抗体的用量跟反应时间都要重抓... 不然 background 会很糟糕 还有就是 Millipore 的产品感觉 "水水的" 不太好弄 -- 莫非定律: 到了期末才会想起期初曾选了一门课却一直没去上 补充定律: 拿到成绩单才发现上了一学期的课忘了去考期末考 -- ※ Origin: 生命科学 BBS <bbs.life.nthu.edu.tw> ◆ From: 210-85-213-142.cm.dynamic.apol.com.tw