※ 引述《hurp (LentiVirus)》之铭言： : ※ 引述《ginmol (储备博士)》之铭言： : : 我有几个有关western blot的问题想请教各位先进： : : 1. 一级抗体的稀释溶液何种较佳？可使其能够保存重复使用？ : 以Santa Cruz p53 DO-1 antibody为例, 我将ab 1:3000 泡在 1X TBST : with 0.05% Sodium Azide, 可加 4%奶粉. 存放及使用都是在4度C. 这一管东西, : 我平均一个礼拜用一次以上, 回收再用. 再没有补加ab的情况下, : 目前已经迈向第三个月了. 效果依旧很利. : 要注意的是一抗跟二抗之间的wash要充分, 例如 1X TBST 15 min X 4 time. : 把Sodium Azide 充份洗去, 因为这东西好像会影响二抗HRP的活性. : : 2. 是否曾尝试以微量反应体积覆盖membrane的方式进行抗体抗原反应？ : 我是用小塑胶袋封装membrane, 以mini gel的面积来说, 大约6~8 ml的 ab溶液. : 我同学是把membrane 装进 50 ml试管, 也是加 6~8 ml的溶液. 放入摩天轮去转 我们实验室都是用养菌的Agar plate 上面先放几百microliter的抗体溶液(依照membrane面积大小而异) 然後将membrane直立在吸水纸上方沥乾残留液体 将transfer蛋白质那一面membrane朝下泡在含有抗体的Agar plate中 使用此法须注意 1.Agar plate需保持水平否则抗体溶液会乱流 2.尽量不要将membrane靠近plate周围 否则抗体溶液流到plate会因表面张力加速扩散到plate周围 使抗体溶液离开membrane与plate底部交界 : : 3. 一般蛋白loading量约多少较为适当？ : mini-gel, 7.5 mm 厚. 我一般loading从 20 ~ 60 ug, 取决於你想看的protein本身 : 的量多不多. : : 4. AP与HRP系统，何者的讯号强度较高？ : 我个人偏好HRP, 虽然较不方便, 但讯息比较敏锐. 如果你用好一点的ECL kit, : 讯号会很强. : : 感谢各位的回答....... : 以上是小弟的经验, 烦请大家指正. 感恩. 也祝大家实验顺利. --

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