因为话多一点，所以回覆一篇讨论。 首先先谈我的经验与方法。我的经验是还是要从single colony 去挑出stable clone容易 很多。细胞适应抗生素活下来变成抗药性细胞真的没那麽难，且不带过量表现蛋白往往长 得比会表现过量蛋白来得好与快，几次继代後就没有了，所以容易挑出只有抗药性的细胞 。 你的clone有带萤光，我的经验来说从单一细胞挑不是很难挑。Transfection後一到两天 从显微镜下看到有萤光，直接算500或1000颗同时含有G418分种在96 well，大概1周後用 萤光显微镜观察，後续挑出只有长出一个clone且带萤光的well再放大，最後以WB确认ove rexpresstion即可。 那回到一开始的问题，细胞产生抗药性的方法或产生基因静默的可能性很多，如果真的想 知道之後再做讨论吧。但我相信这不是你当下想解决或是深究的重点，对你的後续实验也 无益，所以先暂时忘了它吧。 再来延伸出去的我想讨论的是“stable clone” 这件事，我遇到过有的老板会认为挑出s ignle colony的细胞不能完全反应这个细胞株的生理特性，因为这是“这颗细胞自己”在 受到强大的逆境後所产生出的新的特性，而不是“这群细胞”所表现出的特性，所以他们 反对这种做法。我自己在投稿也遇过reviewer针对我每个用“stable clone”的图提出质 疑，哪怕我已经用3个不同的stable clone验证我的结果，他revise每个“stable”也都 刻意标引号，最後我只好再以transient expression补一些实验他才放我过。但不是每个 人都会在意这点，不论是一群或是单一细胞的stable cell line我觉得还是先求有再求好 。 最後，要用什麽样的细胞株进行後续实验仍取决於你的老板是否接受，所以跟他讨论看看 吧。有萤光的细胞株要挑不会太难，所以别太气馁。 以上碎碎念供参。 ※ 引述《belzy (zy)》之铭言： : Transfect新手研究生 : 要做overexpressed stable cell line，Insert 後面接红色萤光当标记（有IRES也有 直? : 做fusion的组别) : 之前有先测试g418的浓度（800ug/ml) : 现在遇到的问题是，在筛选之後有一些不会表达萤光的细胞长得很好，跟有萤光的混在 一 : 分不开，是因为我一开始筛选的时候细胞不够散吗？ : 分盘之後再筛，没有萤光的依然长得很好，已经会长得很均匀而不是团块的样子，还是 没 : 法只把有萤光的细胞分出来 : 想请问那些没有萤光却活下来的细胞，是萤光的promoter没有被推动但是g418的promot er : ，还是筛出了有抗药性的细胞？？还是其他原因？ : 还想请问我现在这个状况有什麽补救的方法吗？ : 感谢各位前辈们 : 在stable cell line卡好久卡到想休学了…orz --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 101.12.27.103 (台湾) ※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1704417367.A.74E.html