作者bill00202000 (handsome)
看板Chemistry
標題[實驗] HPLC 定量與peaK問題(初學者)
時間Fri Feb 2 22:54:12 2018
機型:Hitachi 5110
管住:NH2P-50 4E
size: 4.6 (ID), 250(Length)
particle size(um) : 5
移動相:75% 乙腈
流速: 1 ml/min
偵測器: RI dector, 5450 refraction index detector(Hitachi)
因為前人的數據有問題，老闆希望解決，所以小弟要打HPLC，修正此問題，但小弟從未碰
過，所以想請教各位大神一些問題，
其問題是樣品經過酵素反應後，經過稀釋並加入乙腈調整至75%，打HPLC偵測剩下多少糖
類和合成多少，結果Total的量超過原本反應前的含量，老闆推測是lactose和sucrose定
量有問題，因為樣品中的lactose(9分鐘)和sucrose(8分鐘)之peak無法分開(如圖:
https://imgur.com/a/Z0vZr，但參考各文獻除機型外，其餘條件相同，lactose和
sucrose之peak卻可以完全分開，不知是因為機型問題還是其他原因?
若lactose和sucrose之peak無法分開，定量面積(面積是系統自己計算)會受到影響嗎?
那是否可以用lactose和sucrose混合後打HPLC製成一條標準曲線，再去定量前人結果嗎?
若要將兩者peak分開，除調整移動相濃度外，溫度和流速會有影響嗎?
最後的問題是，若更改條件將lactose和sucrose之peak分開，以此條件，將lactose和
sucrose混打製成標準曲線，再用原本條件將lactose和sucrose混合後(peak未分開)製成
標準曲線，兩者曲線比較找出換算的係數，把前人的數據帶入後修正結果，此法是否能修
正前人定量的問題
麻煩各位大神可解答小弟疑惑，感恩不盡
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.120.104.80
※ 文章網址: https://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Chemistry/M.1517583254.A.CCB.html
※ 編輯: bill00202000 (140.120.104.80), 02/02/2018 22:56:46
1F：→ jerry9437: Column效能是否有降低？ 02/03 09:18
column是新的，效能應該不會這麼快降低
※ 編輯: bill00202000 (110.28.73.101), 02/03/2018 14:36:25
2F：推 zxcvb25206: 儘管都是c18的管柱 也會因為特性不同 而有不同rt 能吧02/03 18:51
3F：→ zxcvb25206: peak分開的方法有很多 最重要你要先要概念02/03 18:51
4F：推 zxcvb25206: 文獻給的參數不是通用的 多少會有些微差異 而不同條 02/03 18:53
5F：→ zxcvb25206: 件的數據也不能混合使用 哪有這麼省事的啊02/03 18:53
6F：→ zxcvb25206: 你那樣算造假了 因為不是用新條件跑出來的 02/03 18:54
7F：推 zxcvb25206: 溫度 管柱長度 移動相比例 流速都會影響 你要先有概02/03 19:42
8F：→ zxcvb25206: 念 才知道要動哪個參數 但就算try出新條件 你終究要02/03 19:42
9F：→ zxcvb25206: 重做前人的樣品重新分析 沒有什麼可以換算的 論文造 02/03 19:42
10F：→ zxcvb25206: 假沒聽過嗎？ 02/03 19:42
11F：→ tony15899: 請寫出管柱規格 02/05 12:51
感謝樓上的回答，換算這件事我知道不可以，但此方式不是我能說不要，頭上的人吩咐，
雖然有反應過，呵呵～
管注規格:
NH2P-50 4E
size: 4.6 (ID), 250(Length)
particle size(um) : 5
※ 編輯: bill00202000 (39.12.100.42), 02/06/2018 23:44:28
※ 編輯: bill00202000 (39.12.100.42), 02/06/2018 23:45:44
12F：→ tony15899: 稍微降低ACN濃度或是流速02/07 00:40
13F：→ tony15899: 也可以考慮減少進樣量(稀釋樣品濃度)02/07 00:46
14F：→ tawin: 還有column溫度可以改變看看02/08 00:36
15F：推 DEATH1122: 如果真的有兩根peak 8/9分 但 重疊 就打稀一點的sample 02/08 20:32
16F：→ DEATH1122: 吧。 02/08 20:32
17F：推 sisay: NH2管柱分析糖的控溫有希望分開 02/09 02:21
18F：→ sisay: 不過好像要高溫 02/09 02:22
19F：推 zxcvb25206: 減少inj. Volumn不是解決方法 可從mp 流速 溫度下手 02/09 19:10
20F：→ zxcvb25206: 比較實際 02/09 19:10
21F：→ zxcvb25206: 不同品牌的column與長度也會有差異 即便相同規格與長 02/09 19:12
22F：→ zxcvb25206: 度 不同牌都可能不一樣 02/09 19:12
謝謝樓上的各位解答
管柱溫度目前一直採用50度，
而流速部分已有嘗試，降至0.5ml/min，對於peak低農度的標準品可分開，會在嘗試各位
提供的建議，感謝萬分
先在此祝大家新年快樂，狗年好運旺旺來
※ 編輯: bill00202000 (39.10.36.206), 02/12/2018 19:06:33
23F：推 tony15899: 依照原廠分析條件應該是不需要用到50度 02/13 13:29
24F：推 ynot010557: 買一隻糖柱 用90度打 03/10 12:58
25F：→ ynot010557: (離子交換柱) 03/10 13:08