各位神人您好 在下是個研究生 最近欲使用glucose oxidase氧化葡萄糖產生H2O2 利用自己和成的納米纖維(具有peroxidase activity)將H2O2分解成自由基 使得氫氧自由基(OH dot)與顯色劑TMB反應而顯色 目前遇到的困難是 實驗不管怎麼做都無法顯色 相關實驗步驟如下: Solution preparation: 1.Glucose oxidase – 取定量GOD粉體，直接溶於pH5的醋酸緩衝液(1 mg/ml)，直至變為 黃色均勻溶液後，直接放入冷凍庫(-18.5 o C)冷凍。 2.Glucose solution – 取定量glucose粉體，溶於DI water中，待完全溶解後直接放入 冷藏(~2 o C) 3. TMB stock solution – 取定量TMB粉體，溶解於DMSO，配置成20mM的stock solition 後，放入冷凍庫(-18.5 o C)冷凍。 Procedure: 1. 先將預先配置好的glucose oxidase solution於冰浴中退冰，然後將0.5ml磷酸鈉(pH 7)緩衝液及0.1ml葡萄糖溶液加入2ml體積的eppendorf中，待GOD退冰後，取0.1ml再加入 上述的eppendorf中。 2. 將eppendorf用隔水加熱方式，於37oC下加熱30min(在暗室下操作)。 3. 取3.8ml的醋酸緩衝液(pH 4)及1mg ZnFe2O4粉體，置於事先用鋁箔紙包裝好的樣品瓶 (~20ml的體積大小)內，隔水加熱37oC。 4. 待eppendorf內溶液反應時間到，直接加入於上述的樣品瓶內，同時再添加0.1ml的 TMB solution，然後反應計時30min。 5. 待反應時間完畢，將樣品瓶內溶液取定量體積出來離心沉澱後，取其上層液體，直接 做UV-Vis光譜儀光學量測，量測波長為653nm。 所使用的GOD根據sigma所提供的物質資訊，其比活性為100,000U/g，而之前實驗中，我添 加0.1ml的GOD(1mg/ml)，經換算大約為10U。根據sigma定義的1U為: 在pH5.1的醋酸緩衝液，溫度為35度時，其每分鐘可氧化1μmole的葡萄糖。 實驗中所添加的葡萄糖量為: 490mM(初始配好的溶液) x 0.1ml(所添加的量) = 49μ mole 雖然在本實驗反應條件為pH7且環境溫度為37度，並非pH5.1且35度，但大略計算其活性， 大概可消耗10U x 1μmole/U-min x 30 min = 300 μmole 葡萄糖，也就是相對可產生 300μmole的過氧化氫。 由於實驗做不出來，因此我根據上面的理論計算，我直接跳過GOD氧化葡萄糖的過程，直 接添加配置好的H2O2溶液(490mM)。並且將實驗步驟稍微更改為: 1.取0.1ml，490mM過氧化氫溶液及0.6ml (0.5 + 0.1，多添加0.1乃是為了使反應濃度可 與之前實驗依樣，因此多添加了0.1ml，這樣可使整個反應體積為0.7ml )磷酸鈉緩衝溶液 於eppendorf中。隔水加熱30min於37度下。 2.接下來的實驗方式都一模一樣。 結果利用此種方式可以得到相當明顯的顯色 根據上面的方式，我還做過49mM以及4.9mM的H2O2 最低濃度也是略有顯色 葡萄糖氧化酶才剛買沒多久，應該不會出問題 因此很困惑 最原先的實驗方式是否有哪裡出錯了呢? --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.115.63.220 ※ 文章網址: http://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Chemistry/M.1398092237.A.A2A.html