作者skywings28 (CPU)
看板Biotech
標題[求救] 純化蛋白
時間Tue Sep 1 01:53:54 2015
目前自己用E.coli產帶有His tag的protein
因此會利用Ni+ affinity beads去抓下來
主要步驟為
1. 15ml sample跟beads(50ul)在旋轉盤binding O/N
2. 利用column(空的)把beads留住
3. 用10mM 10ml imidazole來wash
4. elute 用250mM 200ul
就結果來看
有八成的蛋白(包含目標蛋白)都在flow through
一成多elute出來
雜質少
但是產率低
想問大家這個流程是否可以有修改的地方
希望能提高回收率
p.s.有人有用過vivaspin嗎 想問一下正確用法
按說明書做
用新的管子10ml sample離了"半天"只離掉下來5ml= =
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 118.166.210.112
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1F：推 DrPiGu: vivaspin的樣品要進去之前都要過0.45或是0.20濾膜不然會塞 09/01 07:19
2F：→ DrPiGu: Flow through過高我猜是overload 進樣量要再調整 09/01 07:20
3F：→ huosheng: 同意樓上, beads的結合量原本就不能預期太多 09/01 09:09
4F：推 rasaze: 先算一下你預估產量跟beads用量吧 09/01 09:19
5F：→ skywings28: 所以有可能是beads量不夠囉?還是說減少loading量下手 09/01 11:32
6F：→ kg9101266: 敘述太少 無法幫您 要不要放個data圖 標清IN是濃縮幾倍 09/01 19:06
7F：→ kg9101266: loading量佔樣本的幾% 順便看一下誘導前後的圖 09/01 19:07
8F：→ kg9101266: 題外話 我們用Talon Bead效率非常好 好到只要換tag就 09/01 19:07
9F：→ kg9101266: 想哭 因為其他tag的純化系統跟Talon比差太多 09/01 19:08
10F：推 abcam: vivaspin不好用啊～～ 09/01 21:04
11F：推 skyken10: 請問是用哪個品牌的Ni beads? 09/01 23:55
12F：→ skywings28: sigma的 09/02 01:09
附上部分data
http://imgur.com/9PON5JO
由左至右 依序是 induction前、後、加beads前、blank、flow through、wash、elute
菌液是養250ml 很明顯elute只有一點點
※ 編輯: skywings28 (118.166.208.52), 09/02/2015 01:30:34
13F：推 gps0110: 用maker estimate一下你蛋白的表達量 廠商應該有beads bi 09/02 03:02
14F：→ gps0110: nding capacity的資訊 09/02 03:02
15F：→ gps0110: 如果你的beads不是像前面幾位版友說的量不夠 09/02 03:04
16F：→ gps0110: 忘了問 你的lysate (binding buffer)有沒有含imidazole? 09/02 03:04
17F：推 gps0110: 不過感覺起來蠻像是前面版友說的你beads不夠 09/02 03:07
18F：→ skyken10: 我曾經有跟你ㄧ模一樣的情況，也是用sigma的beads，後 09/02 08:00
19F：→ skyken10: 來把flow through再加入GE的beads，再純化ㄧ次，問題就 09/02 08:00
20F：→ skyken10: 解決，證明不是蛋白質與純化步驟的問題，完全是sigma be 09/02 08:00
21F：→ skyken10: ads的affinity很差，根本與說明書上寫的差很多，小小經 09/02 08:00
22F：→ skyken10: 驗與您分享！ 09/02 08:00
23F：推 kg9101266: 看起來幾乎不抓 在binding上就有問題了 你有確認過誘導 09/02 13:52
24F：→ kg9101266: 後的蛋白是在sup嗎? 另外可能要請你去查一下bead抓蛋白 09/02 13:54
25F：→ kg9101266: 的量 因為沒有標註到底每個lane是loading原樣本的多少 09/02 13:54
26F：→ kg9101266: 比如說 我IN有1900uL loading 5uL 就是5/1900 09/02 13:55
27F：→ kg9101266: 去估算這個東西可以幫助你追蹤蛋白跑哪去 不過初步看 09/02 13:56
28F：→ kg9101266: 會不會是珠子加太少? 09/02 13:58
29F：→ skywings28: flowthrough部分 我是in 10~15ml loading 12uL 09/02 14:59
30F：→ skywings28: 珠子capacity為 15mg/ml gel 上面有人說實際上更低 09/02 15:01
31F：→ skywings28: IN 指的是flowthrough整個的體積 還是煮蛋白的量? 09/02 15:03
32F：→ skywings28: 煮蛋白我是40ulsample +10uldye 09/02 15:03
33F：→ Ice9: 那elute過後，煮beads的data有嗎？另外，你induced前後看來 09/02 17:14
34F：→ Ice9: 差異似乎不大啊。Induction條件要再調？ 09/02 17:15
35F：→ Ice9: 還有，我不覺得雜質少啊。你把圖用photoshop調成和誘發前一 09/02 17:18
36F：→ Ice9: 樣的畫面樣子，就可以看到其他bands也跟著出現。 09/02 17:19
38F：→ kg9101266: 如果你只染膠不做WB的話蛋白表現多嗎？ 09/03 03:26
39F：→ skywings28: 染膠的話其實主要的band 很弱 flow那個很明顯 09/03 12:26
40F：→ kg9101266: 你在南部嗎？我覺得這過程敘述很難說清楚，因為你做wb, 09/05 03:21
41F：→ kg9101266: 我不知道你蛋白誘導量多少，也無法知道15ml含多少目標 09/05 03:21
42F：→ kg9101266: 蛋白，破菌和純化buffer為何，為何要o/n孵育，誘導的蛋 09/05 03:21
43F：→ kg9101266: 白折疊正常嗎？做小量純化測試看看？bead是否有問題， 09/05 03:21
44F：→ kg9101266: 在南部可以約一下討論，甚至借你一些talon bead用看看 09/05 03:21
45F：→ kg9101266: 。 09/05 03:21