最近在做一個cloning，做了一個多月已經想不出別的辦法了，特來求教 vector length: 4.1kb （pAcGFP1-1） insert length: 2.9kb （PCR product as with restriction site at both ends, and several bp extension） 利用sticky end（HindIII & SacII）做為insert接入vector的切位 在ligation之前，先各以Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol（以下簡稱PCI）純化 做完double digest（兩個RE都是Promega的）之後直接跑膠做gel extraction 然後就測定濃度並做ligation（by Promega T4 DNA ligase） 曾經測試過的ligation reaction condition包括： 4℃ overnight、16℃ overnight、Room Temp. for 2hrs and 4℃ or 16℃ overnight、 Room Temp. overnight（以上皆為代理Promega的勁因公司提供的建議） 曾經試過的vector：insert molar ratio包括2：1、1：1、1：2、1：3 （total DNA控制在不到100ng） （附註：後來拿ligation產物跑電泳，皆發現一塊大於10kb的smear區域， 光拿pAcGFP1-1跑不出這種長度） 曾經使用過的competent cell包括益生的ECOS101及 （每個reaction皆將所有ligation product全部加入一管competent cell中） Stratagene的XL-10 Gold ultracompetent cell （每個reaction取20ug competent cell，加入1ul的ligation product） （由於這型competent cell對加熱溫度及時間較為注重， 故而前段icebath及heatshock的部分放在0.2ml PCR tube內進行， 之後incubation再轉移到1.5ml eppendorf tube中並加入培養液） 在LB agar plate上使用的抗生素及濃度為Kanamycin 50ug/ml 這樣子做了好幾次都做不出來 請問有做過這個質體cloning的先進或是做過這麼長cloning的先進 我還有哪些實驗細節可以改進的，謝謝 -- ◎ Origin: 中央松濤站□bbs.csie.ncu.edu.tw From: 104.211.192.210.dynamic.ttn.n