少量质体DNA之制备 -------------------------------------------------------------------------------- I.目的 自大肠杆菌菌株中分离纯化pINDLacZ (pINDLacZ上带有b-gal DNA片段)及pT7-6 (其上具有prokaryotic phage T7 promoter)。学习利用Alkaline（NaOH及SDS)、boiling (lysozyme) 及column tip等数种方法，使菌体分解或破碎，以释出质体DNA，（再以phenol/chloroform [注意：会腐蚀皮肤，小心操作]萃取，以去除杂质），最後以酒精和盐类将DNA沈淀。 II.概述 质体DNA是一种独立於染色体DNA之外的环状DNA小分子，通常只有数千个硷基对（kb），它具有自行复制的能力。在生物技术的应用上，质体DNA常被用以选殖特定的DNA，以及表现特定的蛋白质之用。目前应用於质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如硷溶裂法（alkaline lysis）、沸腾法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售之管柱层析套组等。最常用的硷溶裂法效率高、价廉、简单易学为其优点，对分子生物初学者而言，此法为必学的基础技术。其原理乃利用硷性处理质体DNA及染色体DNA，使两者双股打开呈单股状态，再加入酸中和，使单股回复为双股DNA，同时在急速中和反应中，染色体DNA因分子过於庞大以致於硷基匆忙配对，形成一杂乱无序的巨大分子，对水的相对溶解度低而易被沈淀下来。相反的，质体DNA因分子小，两单股DNA恢复原硷基配对快而易溶於水中，故只要经过离心，即可将染色体DNA与质体DNA分离。在实验步骤中，加入Solution I的目的主要是将细菌团块重新悬浮於缓冲溶液中，Solution II含有SDS及NaOH，前者可将细菌溶解，後者可将DNA变性，Solution III是由醋酸及钾盐所形成，前者在於中和硷性，後者则与DNA形成错合物而有利於DNA的沈淀。待加入Solution III後离心，大部分的蛋白质与染色体DNA会留在下面的有机层，而上面的水层所含的质体DNA可用酒精沈淀之，（亦有实验室用酚/氯仿/异戊醇[PCI]萃取以去除残留的蛋白质），再以70％酒精洗涤以去除盐类。 小量制备 (mini-prep) 是从转形过的大肠杆菌寄主中分离质体DNA之快速方法，比用CsCl密度梯度超高速离心的标准大量制备 (large-prep) 简单多了。小量制备出的DNA可应用於分子选殖 (molecular cloning) 实验，例如进行限制?切割及电泳分析等。除了alkaline及boiling methods，重组DNA技术日益进步，新的方法层出不穷，现已有分子生物厂商发展利用管柱层析法 (column chromatography) 进行小量质体DNA的制备，更较传统方法省时，但价格较为昂贵。本实验所使用的pINDLacZ及pT7-6均含有b-lactamase基因，会产生peripasmic酵素，把盘尼西林衍生物ampicillin (Amp)切开，ampicillin主要的作用机制在於抑制细菌细胞壁的合成。 　 III.Alkaline method (硷性溶裂法) 1.本实验是以alkaline lysis的方法进行，其原理是将大肠杆菌以NaOH及SDS分解，并使蛋白质及DNA变性，继之以酸中和。在此情况下，小分子质体DNA在中和後可恢复原状，但大部分的大肠杆菌染色体DNA则无法完全复原而与SDSD-K+所含之复合物一起沈淀下来，可以离心去除之，上清液所含之质体则可以酒精(ethanol)或异丙醇(isopropanol)将其沈淀下来。 2.仪器用具: a. 无菌操作台(laminar flow) b. 桌上型离心机(microcentrifuge) c. 微量吸管(pipetman) d. 真空乾燥机(speed vac) 3.材料: 於实验前一天，将大肠杆菌DH5a分别含质体pINDLacZ及pT7-6接种至3 ml含ampicillin (50 mg/ml)的LB培养液中，并在37 oC下振荡培养过夜。 4.药品及试剂: a. Solution I: 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM glucose b. Solution II: 0.2 N NaOH, 1% SDS (使用前以10 N NaOH与10% SDS稀释配制) c. Solution III: 3 M醋酸钾溶液(KOAc, pH 5.2) d. RNase A: 1 mg/ml (100 ℃ 加热30分钟去除DNase活性) e. TE buffer: 10 mM Tris-HCl (pH8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0) f. 100% 酒精(ethanol)或异丙醇(isopropanol) g. LB(Luria-Bertani)培养液: 10 g tryptone, 5 g yeaste extract, 10 g NaCl in 1 L 5.方法步骤: 1) 将过夜菌液分别倒入1.5 ml微量离心管中以6,000 rpm离心2分钟後，倒去上清液(两种质体均请制备两管)。 2) 沉淀菌体加入50 ml Solution I，剧烈振荡使菌体完全悬浮，置於室温5分钟。 3) 加入100 ml Solution II，盖上管盖後将管子反覆上下摇动3次，不可振荡(Do not vortex!)，置於室温5分钟。 4) 加入75 ml Solution III，亦温和摇匀，置於室温5分钟。 5) 以12,000 rpm 离心5分钟，小心吸取上清液至另一微量离心管中。 6) 加入2倍体积100% 酒精(或0.6倍体积之异丙醇)，混合均匀，置於室温2分钟。 7) 以12,000 rpm 离心10分钟，倒掉上清液，加入70% 酒精清洗一次，置於真空乾燥机中10分钟(欲去除RNA，可加入RNase A使其最终浓度为10~20 ml/ml，再做PCI萃取及酒精沈淀)。 8) 加入50 ml TE buffer或水，以悬浮DNA。 IV.Boiling method (快速沸腾法) 1.仪器用具: 同alkaline method另需水浴槽(water bath)或乾浴器(dry bath incubator) 2.材料: 同前 3.药品及试剂: a. lysozyme: 10 mg/ml in 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) b. NH4OAc: 7.5 M NH4OAc c. STET buffer: 取等体积之16% glucose与1% Trixton X-100, 100 mM EDTA, pH 8.0, 20 mM Tris-HCl, p H 8.0相混合 d. 100% ethanol or isopropanol 4.方法步骤: 1) 将过夜菌液分别倒入1.5 ml微量离心管中以6,000 rpm离心2分钟後，倒去上清液(两种质体均请制备两管)。 2) 加入350 ml STET，剧烈振荡，使菌体完全悬浮，再加入25 ml lysozyme混合均匀，置於室温五分钟，用parafilm将管子封住。 3) 放入沸水中煮40秒(注意:小心烫伤!)，以12,000 rpm离心10分钟，利用yellow tip将白色的细胞碎片挑剔除去。 4) 加入0.5倍体积之7.5 M NH4OAc及2倍体积之酒精，混合均匀，置於-20 oC 15分钟以沉淀DNA。 5) 12,000 rpm 离心10分钟，倒掉上清液，加入70%酒精清洗一次，置於真空乾燥机10分钟。 6) 加入50 ml TE buffer或水，再次悬浮DNA。 　 V.Column tip method 1. 各家厂牌的质体DNA mini-prep kit有不同的方法，不过大体上是大同小异，请依照kit提供的要点指示进行，以下仅以Qiagen tip为例。 2. 材料: 同前 3. 药品及试剂: 由kit提供 4. 方法步骤: 1) 将过夜菌液分别倒入1.5 ml微量离心管中，以6,000 rpm离心2分钟後，倒去上清液，再加入1.5 ml菌液，同法离心。 2) 加入300 ml P1 buffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8.0及RNase A 100 ml/ml)，剧烈振荡使菌体完全悬浮。 3) 加入300 ml P2 buffer (0.2 N NaOH, 1% SDS)，盖上管盖後将管子温和摇匀，置於室温五分钟。 4) 加入300 ml P3 buffer (2.55 M KOAc, pH 4.8)，亦温和摇匀，置於室温5分钟。 5) 12,000 rpm离心10分钟，在此离心之际，准备架好Qiagen-tip 20，加入1 ml QBT buffer (0.75 M NaCl, 50 mM MOPS, 15% ethanol, pH 7.0)於tip中，利用地心引力洗涤。 6) 待QBT buffer流完後，将离心後的上清液加到tip中。 7) 待上清液流完後，加入1 ml QC buffer (1 M NaCl, 50 mM MOPS, 15% ethanol, pH 7.0)，洗涤共四次。 8) 加入800 ml QF buffer (1.2 M NaCl, 50 mM MOPS, 15% ethanol, pH 8.0)，tip下用1.5 ml离心管来接DNA流出。 9) 加入560 ml异丙醇，以12,000 rpm离心10分钟，倒掉上清液，加入70%的酒精清洗一次，置於真空乾燥机10分钟。 10)加入50 ml TE buffer或水，再次悬浮。 -- 摇一柄桂桨，邀你温情河里泛舟 你可愿意？ 河是深了点，但那是思念溪汇成的河流 真爱沉不了 何况还有我深情的双眸相拥你左右 你还在忐忑？ --

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