※ [本文转录自 yesucan 信箱] 作者: [email protected] ("[email protected]") 标题: 台湾红豆杉──抗癌药物紫杉醇的另一个家 时间: Sat Dec 4 15:32:23 2004 作者: brioche ( ) 看板: Biotech 标题: Re: 紫杉醇 时间: Sat Dec 4 02:35:34 2004 ※ 引述《HIbaby (嗨北鼻)》之铭言： : 今天看中时 提到关於紫杉醇的新闻 : 想说 永信为了生产 找了一大片可以生产紫杉醇的树林 : 想问说 这类植物性特有成分 难道不能跟灵芝王之类的 : 利用发酵技术来生产吗? 台湾红豆杉──抗癌药物紫杉醇的另一个家 作者： 何政坤 行政院农业委员会林业试验所育林组 http://www.nsc.gov.tw/popular_science.asp?add_year=2003&popsc_aid=209 台湾红豆杉或称南洋红豆杉，属於裸子植物，是台湾贵重针叶五木之一。 台湾针叶五木包括桧木类、台湾杉、香杉、台湾肖楠与本文所述的台湾红 豆杉，它们都是台湾最珍贵的树种，木材品质优异，被分类为针一级木， 多属於高大的乔木。红豆杉稀疏地分布在台湾全岛海拔二千公尺上下的山 区，在相当於人的胸部高度处，量取的直径都在一公尺以上，树高达二十 公尺以上，树干略扭曲，比起其他四种针叶木，它是树形较矮胖、树姿较 丑的树种。 可是别看它丑，它包被红色假种皮的果实，状如红豆，是所有针叶五木中 果实最鲜艳漂亮的。它的木材也比其他四种颜色丰富，树心的部分是红色， 边缘的部分是黄色，是很好的雕刻用材。木材雕刻家曾将台湾红豆杉木材 雕刻成一人高的观音，售价高达一千万元。 民国七十年代，台湾红豆杉因怀璧其罪，不断地惨遭盗伐；政府查禁後， 初期对没入的盗伐木，采取公开标售的方式处理，在民国七十八年时，一 棵盗伐木标售到一百八十万元，创下台湾盗伐木标售的最高纪录。为了杜 绝这些破坏台湾天然林木的山老鼠，先盗伐再藉政府标售方式合法取得， 在民国七十九年时立法院特地立法禁止台湾红豆杉盗伐木标售，终於澈底 断绝台湾红豆杉遭盗伐利用的厄运。 抗癌药物紫杉醇 约在民国五十五年时，美国的「国家癌症研究中心」从太平洋紫杉的树皮 中萃取出紫杉醇，发现它具有抗癌的效果，经过一连串的临床试验，民国 七十八年正式制成制剂用来治疗卵巢癌与乳癌。由於它的治疗效果甚佳， 使得太平洋紫杉被预言为「二十世纪对人类贡献最大的植物」。 不过太平洋紫杉生长缓慢，从树皮萃取紫杉醇的产量又甚低，以治疗一个 卵巢癌病患需要二公克紫杉醇而言，就需要砍伐二到三棵50～60年生的太 平洋紫杉，如要萃取一公斤的紫杉醇，就需要砍伐二千至四千株的太平洋 紫杉。所以当时一公克的紫杉醇售价高达八百美元，於是全世界研发人员 开始投入如何量产紫杉醇的研究工作。 对林木育种家而言，最直接的方式就是选育高紫杉醇含量的品种，而且最 好是枝叶含有高浓度紫杉醇的品种，毕竟枝叶是可以不断再生、不断采收 的。如果紫杉醇的取得是来自於树皮，因为树木一经剥皮就会死亡，其生 产成本势必过高，而且收成时间也过久。 对化学家而言，则是利用合成的方式，由简单且容易取得的化学单元体合 成紫杉醇，民国八十三年实验成功了，总共经过28个步骤，化学家可在试 管内完全合成紫杉醇，当时可是一件大事！虽然最後合成的紫杉醇产率仅 有0.5％，不过化学家并不气馁，他们知道如果将合成的步骤缩短，就有 商业化生产的价值。 经过多方寻觅，最後发现红豆杉的萃取物中含有浓 度甚高的紫杉醇主结构10－去乙醯巴卡亭III（简称10-DAB），这种成分 在少数红豆杉品种的枝叶中浓度高达1,000 ppm （ppm，每公斤乾重的毫 克数），是紫杉醇的三倍以上。利用10-DAB作为合成的起始物，只要约 10个步骤就可合成紫杉醇，在实验室中的合成率可达80％以上，这种方法 称为半化学合成法，以别於全合成法。 对生物学家而言，是积极寻找可以生产紫杉醇的微生物，他们发现寄生在 太平洋紫杉上的一种真菌可以生产紫杉醇，由於真菌生长快，用来生产紫 杉醇相当看好。 对组织培养学家而言，就是想办法在发酵槽内培养红豆杉细胞，利用细胞 来生产紫杉醇；组织培养学家本来就很有兴趣利用细胞培养生产人类需要 的药物，但是成果并不理想，主要的原因是这些药品的价格还没有高到使 厂商有投入量产的意愿。如今终於有一种这麽昂贵的药物，而且需求量又 不断增加。 根据最近的统计，紫杉醇在全球的市场需求量高达十八亿美元，占所有抗 癌药物市场的25％！因此带动了全世界细胞培养的研究热潮，目前最大的 发现就是找出了一种叫做甲基茉莉酸的诱导物质，它可使红豆杉细胞生产 紫杉醇的产量暴增10倍以上。 另外，目前最热门的生物技术学家又如何看待紫杉醇的生产呢？他们则是 从找寻合成紫杉醇的基因着手，近三年内他们差不多已经将这些基因选殖 出来了，接着便是如何将基因转殖到红豆杉细胞中，甚至是微生物，让它 们为我们生产廉价的紫杉醇。 紫杉醇的原料来源 前面谈了许多紫杉醇的生产方法，经过10年的开发，紫杉醇原料价格从刚 开始的每公克八百美元，滑落到目前的三百美元，价格虽降低颇大，但是 仍相当昂贵。大家一定很好奇，究竟哪种生产方法是原料的主要来源？答 案有点出乎意料，目前是以半化学合成法为主，而原料就是10-DAB，提供 10-DAB来源的植物，主要是欧洲红豆杉的枝叶！ 采取半化学合成法的主要原因，除了10-DAB在枝叶中的含量是紫杉醇的三 倍以上外，另一个重要因素是天然的紫杉醇再怎麽纯化，总会含有微量的 杂质，这些微量杂质会随栽培方法、环境变化而异，造成品管上的困难。 同样是纯度99％的天然紫杉醇，永远难以保证不同批原料的杂质是一致的， 这些杂质均须通过检验，证明它们对人体无害，才能进一步制成药剂。 反之，半合成紫杉醇经过合成步骤，它的纯度高且每批产品品质几乎一致， 合乎药检的标准，尽管比天然紫杉醇生产麻烦，但是生产成本不一定比天 然紫杉醇高。目前10-DAB原料是每公克90美元以下，假如每二公克可合成 一公克紫杉醇，那就是投入180美元可以生产三百美元的药物，仍有120美 元的价差，扣除生产成本後仍有极大的利润。不过这种半化学合成法的技 术已经成为专利了，用此一技术生产紫杉醇，要付出高额的专利费。目前， 国内的制药界另行开发了独特的半合成技术，也可以利用10-DAB生产紫杉 醇了。 当全世界纷纷投入红豆杉属相关树种的开发研究时，台湾红豆杉究竟是否 有潜力发展出跟国外具有竞争力的品种或生产模式？然而，当我们开始注 意到本土的红豆杉是否有开发价值时，已经是民国八十三年的事了，比国 外的研究足足晚了将近五年。因此当国内学者提出台湾红豆杉的优良化学 品系选育计画时，就有人质疑是否可以跟国外具有十分完备的研究机构竞 争？如果真有优良的化学品种，以台湾如此高的土地与人力成本，还会有 生产空间吗？ 当学者们想进一步研发，利用台湾红豆杉细胞培养生产紫杉醇时，就有人 质疑红豆杉细胞的培养技术国外已经取得专利了，台湾有能力跟国外竞争 吗？研发出来的技术可能也在国外专利的范围内，还会有经济价值吗？常 常我们也会自我反问这些问题，最後总觉得为了了解台湾本土的资源，建 立并保存可能产品化的机制，应该责无旁贷地进行相关研究。 前面提过台湾红豆杉的木材价值已经很高了，大家或许认为栽植台湾红豆 杉经济价值铁定极大，可是针对15公分直径小树的年轮加以计算，竟然高 达两百多岁，对於胸径一公尺的大树需要多少年才能长成，就可想而知了。 为了避免这些大树的基因流失，林业试验所在民国八十三年，开始进行台 湾红豆杉的调查与枝叶含紫杉醇浓度的分析；在进行调查分析的同时，也 加以采种，利用种子发芽育苗，此外也采集枝条，利用扦插发根成苗，以 保存该母树的基因；更进一步从优良母树的枝叶进行组织培养，诱导未分 化的细胞团（称为癒合组织）产生，探讨以细胞培养生产紫杉醇的可行性； 最後透过生物技术，将外来基因成功转殖到台湾红豆杉细胞内。 不可否认的，国内对台湾红豆杉的研发工作仍是跟着国外的脚步，但是， 这并不意味着我们的产品就会输给国外。以下就让我们来看看台湾利用红 豆杉生产紫杉醇的研究与产业发展潜力。 利用台湾红豆杉生产紫杉醇 要在国内以大面积栽培台湾红豆杉，再利用机械化采割枝叶以萃取10-DAB 原料，其栽培方式就像经营茶园一样，被选育出来的台湾红豆杉化学品系 必须具备下述条件：台湾现有产业界具备将10-DAB合成紫杉醇的专利技术； 10-DAB在树梢枝叶中的含量必须高过国外品种；枝叶产量高且耐修剪；由 於台湾低海拔面积较多，所以该品系必须具备耐热性，可以在低海拔栽培。 为了选育具有这些条件的品系，於是从全台湾采集天然母树的枝叶，分析 10-DAB的含量，将含量较高的品系筛选出来，利用扦插繁殖法，培育出跟 天然母树基因完全一样的营养系分株，称之为营养系苗，然後将这些营养 系苗栽培到台湾低中海拔，进行生长与10-DAB含量的检测试验。结果发现 有一些优良的化学品系，可以符合上述的条件，在海拔约七百公尺左右， 栽植四年後，它们的枝叶产量每株平均约可生产三公斤，晒乾後约有一公 斤重，可萃取出一公克左右的10-DAB，如果一公顷种植一万株，就可生产 出约10公斤的10-DAB。 此一产值吸引了具有合成紫杉醇技术的台湾制药公司加入量产的研发计画， 目前正积极利用扦插繁殖的技术，采集这些优良化学营养系的枝条，利用 具有定时喷水系统的温室，直接扦插在含有泥炭土与蛭石的介质中，约三 个月就有80％插穗发根成苗，再经三个月培养後，就可移到栽培地栽植。 此项计画预计在五年内建立面积一百公顷的生产区，届时台湾就可以使用 到由台湾红豆杉生产的紫杉醇了。 一般植物细胞培养的方法，都是先采集植物的组织或器官，如叶片、茎段 等，经过酒精与漂白水消毒後，培养在含有营养成分与植物生长激素的固 体培养基中。在植物生长激素的诱导下，让植物的组织细胞分裂成松软的 细胞团，然後将这个细胞团移入含有培养液的三角瓶内，培养液的体积一 般是三角瓶体积的五分之一，约为50毫升，这样可以增加液体摇荡的速度 及溶氧的能力，然後将三角瓶放在回转式震荡器中培养，回转的次数一般 都在每分钟一百次左右。 松软细胞团在培养液中不断地回旋震荡， 1～50个细胞左右的小细胞团就 会脱离原细胞团，最後逐渐成为均匀的细胞散布在培养液中，此一过程称 为悬浮细胞培养。由於细胞整个浸泡在培养液中，吸收养分的面积比固体 培养仅靠接触表面的吸收来得大，所以细胞的增殖速率也远比固体培养的大。 当细胞在培养液中已经快速生长且紫杉醇浓度产量也很高时，这时候就将 它们移到2～5公升的小型生物反应器中培养。生物反应器的基本构造是一 圆柱型玻璃或不锈钢筒，内含搅拌叶片使细胞能悬浮在培养液中，同时设 有通气管，将空气打入培养液内，提供细胞呼吸所需的氧气。因为在相同 的单位面积上，一个生物反应器可以培养比三角瓶大上数倍的容积，所以 在商业性生产时就必须采用生物反应器。如果细胞在小型的生物反应器中 仍然有很高的紫杉醇产量，在商业性量产规模的规画下，此时生物反应器 的容积可高达数十吨。 根据多年的研究，发现利用细胞培养生产紫杉醇，最关键的因子就是优良 的细胞株！就像前面所述的化学优良品系选育一样，来自不同母树的细胞 株，在培养液中的表现也会呈现极大的差异。优良的细胞株需要具备生长 快、紫杉醇浓度高，而且经过长期培养不会降低生产力等特性。经过将近 八年的努力，长期监控数十个细胞株的表现，终於选育出符合上述特性， 可以用来生产紫杉醇的优良细胞株，目前如利用三角瓶培养，该细胞株可 以每天每公升生产五毫克以上的紫杉醇。 根据报导，国外用来培养红豆杉细胞的生物反应器的容积已高达75公吨， 如果将该细胞株放入75公吨的生物反应器中生产，每天将可生产75公克的 紫杉醇，也就是一年可生产约27公斤的紫杉醇！不过目前尚未看到产品。 林试所的研究团队证实将本土选的优良细胞株培养在二公升的生物反应器 中，发现仍能维持很高的紫杉醇产量，此一结果已引起业界的投资兴趣， 规划用更大的生物反应器来生产紫杉醇。 遗传工程与生物技术被认为是影响二十一世纪人类生活最重要的科技。此 一技术是否能用来增加培养细胞的紫杉醇产量呢？答案是肯定的！一个成 功的遗传工程除了要有影响紫杉醇合成的基因外，还要有将基因转殖到红 豆杉细胞的技术。目前已知控制紫杉醇合成的基因大约有10个以上，其中 最重要的基因是将10-DAB催化为巴卡亭（BC）的去乙醯巴卡亭转移酉每 （DBAT）基因。 由於控制紫杉醇的基因数目太多了，在遗传工程上要将这麽多的基因全部 转殖到红豆杉细胞上，技术甚为困难，通常会选择最关键的基因转殖，来 达到目标产物生成的目的。10-DAB与巴卡亭都是极佳的产物，因为它们均 可经半合成而成为紫杉醇，而且分子大约是紫杉醇的三分之二，细胞较容 易将它们释放到培养液中，所以从培养液中可以不断地得到此二项产物。 如果将可令DBAT大量合成的顺义DBAT基因或可抑制DBAT合成的反义DBAT基 因转殖到红豆杉细胞内，前者会增加DBAT基因的表现，使10-DAB快速合成 巴卡亭；而後者刚好相反，将DBAT基因的表现抑制，所以细胞仅能合成到 10-DAB，如此一来细胞就仅能生产10-DAB产物。目前研究人员已经成功选 殖出DBAT基因，并且尝试将它转殖到台湾红豆杉的细胞内，预期它能够对 细胞生产10-DAB产生影响，又因为它的分子量小於紫杉醇，可以不断地分 泌到培养液中，这样就可以建立连续收获10-DAB的生产模式。 目前基因转殖的方法虽然很多，但以农杆菌为媒介的转殖法最为常用。农 杆菌原是一种土壤的病原菌，当植物受伤时，细胞会分泌一种酚类物质， 诱使农杆菌内的小环形染色体（称之为质体）中的一段去氧核醣核酸（DNA） 切离菌体，移转到植物细胞内，并嵌入细胞内的染色体中，让植物细胞产 生该段DNA上的各种功能。 该段DNA具有生产促进细胞产生肿瘤或不定根的植物生长激素基因，以及 供农杆菌生长的特殊营养成分。当植物细胞带有该段DNA後，就会形成肿瘤， 或者形成毛状根群。如果利用野生的菌种去感染台湾红豆杉，就会产生可 自行生长的细胞肿瘤或毛状根群，与正常细胞需要植物生长激素才能生存 完全不同。由於此一段DNA插入到植物细胞染色体上的位置不同，插入的数 目也不一样，因此转殖基因细胞与毛状根群在生产紫杉醇的表现，也会产 生很大的差异。 目前它们的生产量尚低於正常的细胞培养，不过生长速率却相当快，培养 容易且带有独特的基因标志，不会侵犯到目前许多的细胞培养专利技术是 其重要的特性。林试所从许多野生的菌种中筛选能够很快感染台湾红豆杉 的菌株，它们的感染率可高达30％以上，选择此一菌种，利用遗传工程的 技术，将致病的基因切除改植入DBAT基因，然後再去感染台湾红豆杉的细 胞，这样就可获得转殖DBAT基因的红豆杉细胞了！ 利用台湾红豆杉生产紫杉醇，在可见的未来，将会为台湾创造数十亿元的 商机。利用大面积栽培台湾红豆杉是比较传统的生产方式，投资额大，但 植物产量容易控制，风险低。利用细胞培养或根部培养，是一种可以用自 动化工厂经营的生产模式，然而每一个制程都必须小心，防止生物反应器 可能遭受到细菌与霉菌的污染，同时还要防止细胞在培养过程中难以避免 的变异（突变），也就是说每批产品可能会有相当程度的差异，不过由於 目前细胞的产量颇高，细胞轻微的变异仍可以忍受。为了防止细胞变异的 发生，需要开发出低温保存细胞的方法，一旦利用生物反应器培养的细胞 劣化，立刻可以用低温保存的细胞加以替换。 转殖有植物生长激素基因的细胞，因培养在不含植物生长激素的培养液中， 产生细胞变异的机率比较小，又带有基因标志，可以避开国外在培养基与 细胞株上的专利，是颇有发展潜力的技术，但仍须进行更多的研究，以提 高紫杉醇的产量。至於转殖DBAT基因以促进红豆杉细胞生产10-DAB或BC， 则是未来看好的细胞培养方式。 虽然国外科学家从太平洋紫杉与欧洲红豆杉选殖出来的DBAT基因已经获得 专利，而从台湾红豆杉选殖出来的DBAT基因与该二树种胺基酸序列的相似 度高达95％以上，如果国内使用该基因必须付专利费；但红豆杉的基因转 殖系统，其技术发展在台湾已颇为成熟，相信一定可以比国外更早一步得 到转殖DBAT基因的细胞，尤其是反义DBAT基因（并未被取得专利），以大 量生产10-DAB供台湾业界直接使用。 最後，在台湾红豆杉的研究过程中，让我们深深地体会到研发技术固然重 要，但拥有丰富的植物资源更为重要！如果我们研究的是外来品种，要选 出优良的化学品系本身就很困难，要适应台湾的环境更是需要漫长的时间 检验。台湾红豆杉的研发脚步虽然慢，但是整个研发体系是建立在最基础 的传统育种收集，到各种珍贵品系的选拔，才能建立自有的化学品系、细 胞培养与遗传工程技术，加上国内的制药界也不断地追求技术的创新，让 国内的研究团队，能够有机会利用本土的台湾红豆杉，为台湾创造大规模 生产紫杉醇的产业。 --

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