http://72.14.235.104/search?q=cache:s3PHX32-atUJ:www.ce.mit.edu.tw/bioeng7/91%E7%94%9F%E5%8C%96%E5%85%A8%E6%96%87%255C172.doc+bromocresol+purple&hl=zh-TW&gl=tw&ct=clnk&cd=25 乳酸菌可以产生乳酸, 降低肠道中之PH而达到抑制肠内腐败菌及致病菌之生长, 同时它 亦可能产生多种抗菌物质可以杀死肠道中之坏菌, 在现代忙碌生活里对我们的胃肠扮演着 重要的角色. 世界各国有关乳酸菌的相关产品相当多, 如A菌, B菌, C菌 , 微胞保护乳酸 菌, 孢子型乳酸菌等, 上市产品又有优酪乳, 乳酸菌粉等健康食品 . 为对乳酸菌的研究作进一步的探讨, 本研究计画进行孢子型乳酸菌之筛选与发酵培 养;以菌种之耐酸性,温度稳定性, 贮存安定性, 抑菌性及加工稳定性等特性为筛选时之判 断标准, 期望能透过此一标准而筛选出一株具优良特性之孢子型乳酸菌出来. 除此之外, 我们亦将以工业界的考量进行高菌量培养, 深入探讨其发酵条件, 利用分批进料法寻求高 菌量培养. 关键词：乳酸菌、孢子型乳酸菌 1. 前言 乳酸菌通常是泛指能够发酵碳水化合物，以产生乳酸为主要产物之微生物，乳酸菌在 多数动物消化道中为优势菌，细胞较大，通常以成只或成串出现；少数具有芽胞，能在很 广围的温度(15℃~45℃)中生长。其具有抑制肠道中有害微生物的生长，调节及建立肠道 内菌相外，其还具有治疗肠内不适所引起之腹泻，降低血中胆固醇，并且改善乳糖不耐症 以及抑制致癌因子及癌细胞等等疗效，就因乳酸菌具有这些优点的存在，因而乳酸菌至今 才会被世界各地延用多年。 虽然在市面上利用乳酸菌所制造出的产品十分众多，例如优酪乳(统一AB优酪乳，光 泉晶球优酪乳…等) ，优格，起司，乳酪，表飞鸣，泡菜…等等相关的产品。但在这些产 品之中能够真正在人体中发生其作用的乳酸菌之菌种十分的少，其主要原因乃是人体的胃 酸值介於PH值2~3之间，而使得许多乳酸菌种根本无法在此低PH值之下生存，根据许多文 献中记载中孢子本身具有高度的耐酸性，耐高温性，及高度贮存安定性，所以我们将考虑 孢子型乳酸菌的探讨，但乳酸菌中会产生孢子的菌种却十分的少见，目前文献上的孢子型 乳酸菌有Sporolactobacillus、Bacillus laevolacticus、Bacillus racemilacticus、 Bacillus coagulans 被应用於益生菌，且具有很好之保健效果。 由於Bacillus coagulans 已被广泛地应用於肠胃疾病，安全性较无问题，且其在好 氧环境生长快速。因此我们将筛选此菌株，对其特性、高菌量发酵培养及产孢性作一详细 研究，以建立一套可以量产化的商业化制程，未来期望能进一步转移给业界进行量产。 2. 实验方法 2.1菌种筛选与监定 动物粪便中分离出多株菌种，将菌体倒入液态培养基（如表一、二），培养24hr，37 ℃。将菌液移至45 ℃培养箱培养48hr，使其产孢。产孢菌液以90 ℃，30min隔水加热， 使其未产孢的菌种死亡。以连续稀释10-2, 10-3後取0.1mL的稀释菌液培养24hr 37 ℃， 以求得单一菌落，再以划线法求得更纯的菌株，并以显微镜观察。利用革兰氏染色、显微 镜观察、作catalase测定、作oxidase测定初步判定是否为凝结芽孢杆菌 ，再以 Biolog 监定系统做进一步监定。 2.2 5升发酵槽发酵分析 利用控制搅拌速率达到合适的溶氧量，利用发酵温度、发酵时间、分批进料 法等，寻求高菌量培养。 2.3菌种的生长条件与营养需求分析 不同温度下的生长性－我们分别考虑25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、,50℃、55℃ 、60℃发酵槽发酵培养。 不同碳源培养基之筛选－我们将分别改变Glucose，Sucrose，fructose，glycerol及 starch，以探讨不同碳源的影响。 2.4寻求凝结芽孢杆菌最佳产孢温度 我们将考虑在35℃~60℃间，寻求一较适的产孢温度。分别考虑不同的温度35℃、40 ℃、45℃、50℃、55℃、60℃培养使其产孢，我们将以眼视与显微镜观察未产孢与产菌的 差异。 2.5孢子对於温度及PH耐受性之测试 孢子菌对於不同温度的耐受性测试： 将产孢的菌液分别取1mL後，各经80℃、85℃、90℃、95℃隔水加热30分钟、60分钟、90 分钟，後取1mL使用连续稀释法，稀释後取1mL接於BCP上，放於37℃培养48小时後计算菌 数。 孢子菌对於不同pH值的耐受性测试： 将产孢的菌液分别取1mL放入pH2、pH3、pH4之液态培养液以37℃培养後30分钟取菌液分别 取1mL接於BCP上，放於37℃培养48小时後计算菌数。 3. 结果与讨论 3.1菌种筛选与监定 目前我们已筛选得一株 Bacillus coagulans 其监定特徵如表三，进一步委托食品研 究所作Biolog 系统监定。 3.2菌种的生长条件与营养需求分析 生长温度测试：在不同之温度下，我们共测试了25℃， 30℃， 35℃， 40℃，45℃ ，50℃，55℃，60℃。 等八种不同成长温度。实验结果如图一所示，由图中可知，30℃ 以下，以及45℃以上菌体成长均不甚理想，50℃以上，菌体成长则完全停滞。温度在 35~45℃之间，菌体之成长情况差异不大，由此可知本株菌是属中温菌属，未来应用在人 体，动物之保健用途上甚为适合。 碳源之筛选，本研究共测试了包括Glucose，Sucrose，fructose，glycerol及 starch。等多种不同碳源，经测试结果以sucrose，glucose，starch可达较佳之成长， 但与其他碳源之比较其优势并不很明显〈图二〉，因此可以推论本菌株对碳源需求并不具 特异性，这可能归因於此株菌属野生型，又营养需求较为宽松。 最佳产孢条件，为获得较好之产孢率，本研究亦针对产孢温度进行筛选比较，由图三 可知，菌体培养温度要在45℃以上，才开始进行产孢。低於40℃ 以下产孢情况非常差，产孢速率亦很慢，而在55℃以上，菌体在未产孢前到大量死亡，产 孢率亦不佳。在45~50℃应为最佳状况。若配合糖浓度之侦测，可以发现在45℃时，耗糖 速率加快，在8~12小时内，发酵液中之糖浓度会降至零。这可能是造成在此温度范围内, 产孢率较佳的原因。 孢子对pH耐受性测试，由於保健用乳酸菌需通过胃酸之严苛挑战，才能顺利到达肠道 。因此乳酸菌对酸性条件之耐受性是一个非常重要的特性。由图四可知，本株菌在pH3以 上，耐受两小时其菌体存活率几乎不受影响。在PH2时，一小时内，菌体存活率仍在90%以 上，2小时以上存活率降为80%左右。因此本株菌在商业使用上，应较一般市面上所贩售之 乳酸菌制品，具有更佳之耐酸性。 孢子对温度之耐受性测试，在加工过程中，乳酸菌制通常会接触到高温条件，尤其是 粉末或锭剂制品均需由高温加以乾燥，因此对高温度之耐受度是乳酸菌制品另一个非常重 要的特性。由图五结果可知，既使温度在90℃以上，30分钟内，菌体存活率仍不受影响。 1小时以上，生菌数才会下降，这个结果亦较一般之乳酸菌为佳。综合以上结果可知，即 使温度在90℃以上，30分钟内，菌体存活力仍不受影响。1小时以上，生菌数才会下降， 这个结果亦较一般之乳酸菌为佳。综合以上结果可知，我们筛选到之乳酸菌的确具有较佳 的耐酸性，抗温性及加工稳定性，未来应用在商业化生产上应有很大之潜力。 4. 结论 目前已筛得菌株Bacillus coagulans，并已用5L发酵槽发酵得OD值达到10(菌数大约 为5*109只/c.c)，已达商业化生产标准。接下来将利用多次进料进行高菌量培养及用100L 发酵槽进行试量产试验。 5. 谢志 感谢国科会（NSC 89-2214-E-218-003）计画的经费补助 6. 参考文献 凌代文编着.乳酸菌细菌分类监定及实验方法.1995. Nakajo M.& Moriyama Y. (1993), 」 Effect of PH and water activity on heat resistance of spores of bacillus coagulans」 , J.Jap. soci.: Food Sci. and Tech., 40(4):286-271. 吉田龙行,森茂行,石井资治」宫入氏菌芽胞之生产方法」中华民国 6811910号. 朱文深(1994),」乳酸菌之遗传工程研究」,食品工业.26(3):13-23. Junichiro H., Hiroshi M. & Tetsuro W., 」 Microbe-Based Deodorant」 ,JP2258011A. Atsushi K.,」Bacillus coagulans of heat stable lactic bacterium 「 ,JP11075829A. Fujio H., 「Blended Preparation of Drug-Resistant Live Bacterium Agent for Controlling Intestinal Functin And Antibacterial Agent」, JP1083025A. Hirpbumi T. & Masakatsu H., 「Stabilization of Lactobacillus sporogenes」, JP10327846A. Adami A., 「A Bacterial Strain of the Species Bacillus cogulans ;Its Use as a Probiotic Agent 「, WO93/14187. 10.中条均纪,森山裕子.凝结芽孢杆菌孢子的耐热性及水活性测试.1993. 11.旋宗雄.台湾乳酸菌类研究之介绍及在饲料添加剂上之应用.生物产业.1998. 12.蔡英杰.乳酸菌与其应用特辑序.生物产业.1998. 13.李福临.乳酸菌分类之研究近况.食品工业月刊.2000. 14.蔡英杰.乳酸菌应用综论.生物产业.1998. 15.廖启成.乳酸菌之分类及应用.食品工业.1998. 表一. 固态培养基(BCP) 表二. 液态培养基 Glucose 1g/L Glucose 0-15 g/L 酵母萃取物 3g/L Peptone 0-7.5 g/L Bromocresol purple 0.04g/L 酵母萃取物 0-4.5 g/L L-Cystein 0.2g/L Maltose extract 0-4.5 g/L Peptone 5g/L PH=6.8 Agar 15g/L Tween80 1㏄/L PH=7.0 表三. 凝结芽孢杆菌监定特徵 特徵 反应 细胞形态 杆状细胞 芽孢形状 卵圆或球形 厌氧生长 _ 色素 + 革兰氏染色 + 最高生长温度 60℃ Catalase活性 + Oxidase活性 _ --

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