http://www.yaofen.com/fxjsread.asp?id=1536 随着科学技术的进步，对液相色谱技术的要求也不断提高，单从技术角度的改进已经不行 。这就需要同时从科学与技术的角度出发，或者说从理论高度对液相色谱重新认识。因此 ，UPLC（超高效液相色谱）概念得以提出，将HPLC的极限作为自己的起点。 　　在1996年，Waters公司推出Alliance HPLC时的主要目标是提高液相色谱的「精 度」。当时多数公司都认为HPLC技术已经发展到极致了、而同时用户对性能没有更高的需 求，因此HPLC的目标应该是降低成本、走向更低的价格以获得更广泛的应用。针对这样的 观念，Waters公司提出：HPLC的技术没有到达极限，用户对HPLC有更高的要求，HPLC精度 的提高对更好、更可靠的结果有极大的益处，对法规的遵从也是一个极大的促进。 　　 站在当今世界科技前沿的液相色谱用户现在又有了新的需求；首先是改进生产力 的需求，因为大量的样品需要在很短的时间内完成，例如代谢组学分析；其次是在生化样 品及天然产物样品的分析中，样品的复杂性对分离能力提出了更高的要求；第三是在与MS 及MS/MS等检测技术联用时，对连接的质量提出了更高的要求。简而言之，我们需要「更 快地得到更好的结果」 　　 今天我们发现，随着科学技术的进步，对液相色谱技术的要求也不断提高，单从 技术角度的改进已经不行。这就需要同时从科学与技术的角度出发，或者说从理论高度对 液相色谱重新认识。因此UPLC（超高效液相色谱）概念的提出也就十分自然；简单的说： UPLC是用HPLC的极限作为自己的起点。 理论基础 　　 早在1956年，J.J van Deemter就发表了他着名的理论：van Deemter曲线及其方 程式。最早这个理论是用在气相色谱上的，但是後来出现的液相色谱上也能应用这个理论 。Waters公司引入UPLC的概念就是由研究这个着名的方程式开始。 　　 首先探讨一下这个着名的方程式。如果只关心柱效（H）与流速（线速度；u）及 填料颗粒度（dp）之间的关系，就可以把该方程式作如下的简化： 　　 　　 其中：A项代表了颗粒度和柱床填装的优良程度；B项代表了轴向扩散；而C项则 代表了传质。从不同颗粒度的曲线中我们可以看到如下图所示的现象： 　　 首先颗粒度越小柱效越高；其次每个颗粒度尺寸有自己的最佳柱效的流速；最後 ，更小的颗粒度使最高柱效点向更高流速（线速度）方向移动，而且有更宽的线速度范围 。所以降低颗粒度不但提高柱效，同时也提高速度。使用更高的流速会受到色谱柱填料耐 压及仪器耐压的限制。反之；如果不用到最佳流速，小颗粒度填料的高柱效就无法体现。 另外，更高的柱效需要更小的系统体积（死体积）、更快的检测速度等一系列条件的支持 ，否则小颗粒度填料的高柱效同样无法充分体现。 　　 因此，要真正创建一个全新的分离科学领域 －UPLC，必须解决几个问题： * 大幅提高色谱柱的性能；第一要解决小颗粒填料的耐压问题，第二要解决小颗粒填 料的装填问题，包括颗粒度的分布以及色谱柱的结构。 * 高压溶剂输送单元（超过15,000psi）。 * 完善的系统整体性设计，降低整个系统的体积，特别是死体积。并解决超高压下 的耐压及渗漏问题。 * 快速自动进样器，降低进样的交叉污染。 * 高速检测器；优化流动池以解决高速检测及扩散问题。 * 系统控制及数据管理，解决高速数据的采集、仪器的控制问题。 新型色谱填料及装填技术 　　 UPLC?分离只有在新型的、耐压而且颗粒度分布范围很窄的1.7?m颗粒填料合成出 来之後才有可能。 　　 色谱柱技术应该涵盖几个方面的内容：首先是填料的合成，以得到高质量的填料 颗粒，包括：耐高压、耐酸硷等等。其次是颗粒的筛选，选出颗粒度分布尽可能窄的填料 。最後是装填技术，以保证即堵住颗粒不使其外流，又不至於引起反压的大幅升高。 　　 Waters公司利用1999年发明的杂化颗粒技术（Hybrid Particle Technology － HPT；美国专利号：No. 6,686,035 B2），合成了第二代有机硅填料。它使用双（三乙氧 基硅）乙烷在硅胶中形成桥式乙基基团。 这样合成出来填料在其内部有了更多的「交联」结构，其机械强度有了极为显着的提 高，耐压超过了20,000psi。使用这项技术，Waters公司合成了低於2?m颗粒度的填料 － 1.7?m颗粒度的「AcQuity UPLC」填料。为了得到更好的耐压能力及传质作用，还优化了 该填料的孔体积及孔径。 　　 传统色谱柱填料的装填技术受两个方面的影响，导致现有小颗粒填料色谱柱的性 能及质量均不能令人满意。首先是其颗粒度分布一般较宽，例如，5?m颗粒度填料中会有 大量的4?m以下及6?m以上的颗粒，因此通常使用2?m筛板在色谱柱的出口拦截填料，阻止 其外漏。其次；如果使用低於2?m的筛板，筛板的反压升高很快，甚至超过了填料所产生 的反压。因此；目前大多数3.5?m、2.5?m或更低颗粒度的填料还是使用2?m的筛板，只是 在柱头装填一小段5?m的填料。因此现有小颗粒度填料的色谱柱与理论或理想状态相距甚 远。 　　 Waters公司的AcQuity UPLC使用了更严格的筛分技术使1.7?m填料的分布很窄， 并且使用了全新筛板（专利申请中）及其他色谱柱硬件（柱管及其连接件），在超过 20000psi的压力下装填。Waters公司为此安装了一条新的色谱柱装填生产线及新的测试设 备。因此；AcQuity UPLC色谱柱的性能及质量有了质的飞跃。 　　 填料的合成技术、颗粒的筛分技术、筛板及色谱柱硬件技术的提高，在更高的压 力下装填色谱柱是UPLC色谱柱性能、质量保证的关键。 超高压液相色谱泵 　　 Waters公司具备制造超高压泵的能力，UNC的Groove教授所用的超高压液相色谱 泵是Waters公司为其特别制造的。除了密封、高压动力之外，超高压色谱泵主要解决的问 题是超高压下溶剂的压缩性及绝热升温（Adiabatic Heating）。 　　 AcQuity UPLC装备一台独立柱塞驱动、四个溶剂切换的两元高压梯度泵，其 1ml/min流速时的耐压可达15000psi，具有精确、可靠的梯度性能。新型的超高压输液泵 使独特的小颗粒填料技术可以在最优化的流速下工作，以充分发挥其特点。集成改进的真 空脱气技术，使四个流动相溶剂及两个进样器洗针溶剂同时得到良好的脱气。 　　 其梯度的重现性也非常好，如下图所示，尽管保留时间在1min以内，其重现性却 与HPLC的重现性不相上下。 自动进样器 　　 为了降低死体积、减少交叉污染，自动进样器的设计使用了许多新技术，例如针 内针样品探头（XYZZ』）、压力辅助进样等等。所谓「针内针」的XYZZ』设计，实际上就 是使用液相色谱管路（PEEK材料）充当进样针以减少死体积，而「外针」是一小段硬管， 用来扎破样品瓶盖。 　　 压力辅助进样在如此小的仪器的系统体积下保证可靠、重现的进样是非常重要的 措施。为了降低交叉污染，采用了一强、一弱的双溶剂的进样针清洗步骤，这两个脱气溶 剂也采取了脱气措施。 高速检测器 　　 然而，在新的色谱柱技术支持下的高压、高速UPLC对AcQuity UPLC结果的检测提 出了挑战。首先是速度问题，在短时间内出现如此多的色谱峰需要更快的数据采集速率相 适应，至少要在10Hz以上，还需要降低样品检测池内的驻留时间。当然同普通的HPLC检测 器一样，信噪比也是新型检测器的追求目标。 　　 尽管因需要降低扩散而不得不使用很小体积的检测池（<1?L），但是仍然要设法 提高光能量通过及传输来降低噪音。同时必须使用更快的采样速率、非常小的时间常数值 ，以适应UPLC所产生的非常窄的色谱峰，见下面的不同采样速率的色谱图。AcQuity UPLC 使用新型光纤引导、Teflon AF池壁的流动池；10mm的光程（与普通HPLC相同）而体积只 有500nL（普通HPLC的20分之一）。光束通过光纤完全引入流动池後，利用Teflon AF的特 徵在池壁内全折射，不损失光能量；同时采样速率达到40点/s。 　　 这样设计的高速检测器不但适应了UPLC?高速及高分辨率的特徵，而且还对UPLC? 灵敏度的提高有很大的帮助。 优化系统综合性能的设计 　　 Waters? ACQUITY Ultra Performance LC?系统的整体设计优化了超低系统体积 及死体积，使之能获得成功的UPLC?所必须的低扩散、高速检测所带来的所有优点，同时 还可以充分利用质谱电喷雾离子化接口的优点。由於这个原因，ACQUITY UPLC?系统会是 理想的质谱接口。 　　 当连接了我们的质谱技术时，ACQUITY UPLC?系统的解决方案可以提供更灵敏的 LC/MS及LC/MS/MS分析。例如；当与Micromass? LCT Premier?连接时，数据的质量与速度 有了惊人的改进。 应用 　　 由於超高效液相色谱（UPLC）是一个新兴的领域，Waters的ACQUITY UPLC?系统 也是刚刚出现，因此目前已发表的应用资料还很缺乏。与传统的HPLC相比，UPLC的速度、 灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍。因此首先想到的UPLC应用是代谢组学分 析及其他一些生化领域。其他目前能够想到的应用领域还包括天然产物的分析。使用UPLC 与Tof或Q-Tof等质谱检测器连接，会对天然产物分析，特别是中药研究领域的发展是一个 极大的促进。 　　 多数生化样品及天然产物都十分复杂，能被分离的色谱峰再多也会觉得不够。下 面这张图是多肽指纹图的HPLC与UPLC两个色谱图（紫外检测）比较。在同样条件下，UPLC 能分离的色谱峰比HPLC多出一倍还多，因此我们有可能进一步研究：保持分离度而追求更 快的分析速度，在相同时间内作更多的样品，或优化分离度在同样时间内再分出更多的色 谱峰。 　　 下面这张图是代谢产物分析的色谱图。在同样条件下；UPLC的分辨率使我们认出 更多的色谱峰（质谱检测器 － LCT）。 　　 在提到「蛋白组学」或「代谢组学」时，与没有「组」的差别从分析的角度说就 是样品量极大，需要在短时间分析成千上万的样品。UPLC不损失分离度的高速度优点在这 里就能充分体现。 本文作者系Waters公司 --

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