(南京农业大学园艺学院　南京210095) 果树种质资源是果树遗传育种的原始材料,在果树育种中占重要的位置。世界各国都很重 视果树种质资源的搜集和保存工作。果树是遗传物质常有变化的异交植物,遗传物质复杂, 通常以嫁接来繁殖;其种质资源的保存不同於遗传均一的自交植物。尤其是热带果树,均以 嫁接方法繁殖,其种子大多为难驯化种子。最近?????(国际植物遗传育种委员会)和部分国 家已开始此项研究并取得了成绩。 1 果树种质资源保存地点 1.1　保护区把天然的生态环境列为保护区,如国家级公园,国家级自然保护区等方式,象新 疆新源县的野果林,福建莆田的宋荔等。但这种保存方式很难完全以人力来进行控制。 1.2　田间集中保存法以植物园、标本园、果园等形式保存,如马来西亚建立的油椰子园, 印尼100??2的可可椰子园,中国的66.666??2芒果园和33.333??2的油梨园,菲律宾的香蕉园 等,管理栽培容易,且能获得经济效益。 1.3　种质资源圃种质资源圃就是集中定植种质资源到适合果树生长的、有一定生态代表 性的圃地,以长久保存。原则上乔木果树每种5株,灌木和藤本10～12株,草本20～25株,重 点品种保存数量可以适当增加。我国目前的种质资源圃有:１梨、苹果圃:辽宁兴城;２葡 萄、桃圃:河南郑州;３柑桔圃:四川重庆;４５桃、草莓圃:北京和南京;６枣、葡萄圃:山 西太谷;７李、杏圃:辽宁熊岳;８柿圃:陕西眉县;９沙梨圃:湖北武昌;(10)核桃、栗圃:山 东泰安;(11)龙眼、枇杷圃:福建福州;(12)香蕉、荔枝圃:广东广州;(13)寒地果树圃:吉林 公主岭;(14)山楂圃;辽宁渖阳;(15)特有果树、砧木圃:云南昆明;(16)新疆名特果树圃:新 疆轮台。以上种质资源圃1989年全部建成通过验收。 1.4　原生境保存原生境保存是指在自然生态环境下保存野生植物群落或农田中的栽培植 物种群,这些种群是农业生态系统的一部分。一般来说,产生一种植物基因遗传多样性的原 因有以下方面:(1)未受人为选择影响的自然选择;(2)多变化的耕作制度中植物进化、选择 和适应;(3)有目的的正规育种。传统的耕作制度也能产生植物遗传多样性。原生境保存的 目的是既保存遗传资源,又保护产生遗传多样性的进化环境。相对异生境来说,原生境保存 能使植物保持进化和对其环境的适应能力;保存所有水平的多样性,即生态系统多样性、物 种间多样性和物种内多样性;改善贫困农民的生活;维持或提高农民对遗传资源的控制和获 取能力,通过选择他们喜好的农艺性状和品质性状而影响到一个种群的遗传结构。他们选 择一种特定的农田管理措施,或在一个特殊的微环境下种植一个作物群体,这些都可能影响 到一些基因型的存亡;应把广大农民纳入到国家植物遗传资源保护系统中。在果树上,农民 通过选择砧木、接穗及果树生存环境同样影响果树的遗传多样性,如芽变。 1.5　室内保存营养器官保存　多采用枝条和芽,但有时也采用根部保存,一些果树的根具 有再生植株的能力,如石榴、番石榴等。生殖器官保存　一般采用花粉和种子保存。花粉 的缺点是只有半套基因,因而必须是能再生成植株的花粉,才具有保存价值。对於遗传物质 不均一的果树而言,种子保存时必须有相当数量才能保存全部或大部分基因。外植体培养 保存　可分为原生质体、细胞或器官保存,其中以茎尖和分生组织培养的短期效果较佳。 2 不同器官的保存方法 2.1　种子采用种子保存种质的,主要用於野生果树、砧木材料、无融合生殖类型,种子繁 殖的果树如番木瓜、椰子,以及某些实生繁殖的核桃、板栗、桃、杏等的群体品种。严格 地说,果树种子後代的变异大,不能作为遗传上定型的繁殖材料,因此实用价值有限。但利 用种子贮藏是简便而又经济的方法。根据种子的贮存特性可将种子分为正常性(orthodox) 和顽拗性(recalcitrant)种子。此外还有一类种子介於正常种子和顽拗性种子之间,最典 型的如咖啡种子,耐乾燥但不耐低温(不能贮於10℃以下)。顽拗性种子主要包括热带(可可 、椰子)和亚热带植物及水生植物种子(水浮莲、菱、茭白)和温带植物(板栗、栎树),这类 种子脱离母体时不经成熟脱水期,其含水量相对较高且对脱水及低温敏感,因此不耐储藏, 寿命短。如可可在10℃或低於10℃时死亡,芒果在3～6℃亦会受到损害,含水量降低到12% ～31%之间就会使芒果种子生活力迅速下降,甚至全部死亡。对漆树科的芒果、桦木科的欧 洲榛子、柿树科的柿、山毛榉科的板栗、栓皮栎和黑栎等、金丝桃科的凤果、胡桃科的美 国山核桃、核桃、樟科的油梨、桑科的菠萝蜜、棕榈科的可可椰子、油椰子、蔷薇科的枇 杷、芸香科的酸橙、柠檬和甜橙、无患子科的龙眼、梧桐科的可可等果树的种质保存期进 行了研究,其结果是,保存期最长者可达5年,最短者只有20?,绝大多数种子保存期为一个月 。由於顽拗性种子相互之间差异性很大,即使同一物种不同的变种也不一样,因此需要逐个 研究。至今顽拗性种子的保存已取得了阶段性的成果。Hor等将可可种子於17～30℃下保 湿贮存可将寿命自20?延长至70?;将可可种子用杀菌剂处理贮於聚乙烯袋中24周後,还有 50%以上的发芽力。?hin等将红毛丹种子贮於湿活性炭或锯屑中,可以延长发芽力达1个月 。?anson将红毛丹种子在塑料袋中保湿贮藏2个月之久。王晓峰等将芒果种子用电扇吹风 使含水量达到51 0%时,用塑料袋密封,於15℃下贮藏,种子的寿命由室温空气中的8?延长至 7个月,还有65%发芽率。唐林凤等将木菠萝种子先进行部分脱水,使种皮趋於风乾状态後, 置於能适度换气的塑料袋中,在15℃下湿藏,由自然条件下的1个多月延长至815?仍可保持 90%的发芽率。 2.2　花粉保存花粉的目的在於:?、授粉,在不同花期或授粉不良时使用;?、育种,解决花 期不同的矛盾,而且可以随时进行杂交授粉;?、基因保存,花粉具有半套基因,稳定且体积 小;?、便於运输。大多数花粉在0℃左右到-20℃的低温下,以及空气相对湿度在10%至30% 之间,低氧浓度或高二氧化碳浓度甚至无氧条件下,有利於长期保存。最近科学家们认为采 用20℃/min的快速降温配合快速解冻可以使花粉在超低温下保存活性,对温度较敏感的植 物来说,这是有希望的方法。科学家们用冷冻乾燥法保存温带果树的桃和梨的花粉达10年 之久[14],热带果树油梨的花粉,在液氧与0%相对湿度条件下保存1年後,仍能授粉成功。 2.3　枝条和根对於遗传物质复杂的果树,用枝条保存比种子或花粉贮藏有许多优越性,因 为它能繁殖成遗传型稳定的材料,通常要求低温或-2～2℃,并保持相对湿度96%～98%,不使 营养体乾燥失水。目前温带果树如苹果、葡萄、柿、李的枝条可保存1年以上,梨经过2年 -10℃的贮存其嫁接成活率和新采的接穗并无显着差异。然而落叶果树接穗一年至少有7个 月可从树体获得,所以,一般情况下,贮存接穗的必要性很小。利用液态氮来贮存果树枝条 其结果则难以预料。苹果叶芽相当耐寒,不需要使用抗冻剂可直接置入液氮中,但在放入之 前须缓慢降温到-40℃,冻融後用於嫁接,成活率达80%,生长良好。而对於热带的常绿果树 则不同,采样季节、部位以及贮存温度等因素都要特别慎重,如处理恰当,还有成功的希望 。根的贮存对於不需要嫁接的树种或砧木,如石榴、枣树等,利用的可行性高。 2.4　细胞、组织或器官利用组织培养技术保存种质资源具有占用空间小、可免遭自然状 态下病虫为害等优点。材料可采用原生质体、未分化的细胞与愈伤组织分化的芽和胚等。 但最理想的是茎尖和分生组织,因为它们不但在遗传或形态上较细胞或其它部位稳定,且一 般不受病虫侵染,最大优点是再生容易,对於那些属於顽拗性种子的果树,利用茎尖培养更 有特殊价值。保存方式最好利用冷冻保存(-196℃液氮),这种保存方法不但能使其生长速 度停止而且不用继代培养,又能减少植物体突变的机会而达到基因稳定的目的。目前在茎 尖及分生组织方面的研究已获成功。运用这些方法,可可、柑桔和香蕉的保存效果最佳,其 次为葡萄和油椰子等,最後为面包果。组织培养保存在果树种质的繁殖和贮藏上很有前途, 但有两个可预见性缺点。一个是从组培小苗要经过长时间才能长成一株开花结果的树,另 一个是比田间定植增加损失的危险。因此组织培养可作为田间定植的一种补充方法。 3　不同温度下的保存 3.1　低温保存即利用低温对植物生命活动有抑制作用而进行的保存。所用的温度一般为1 ～10℃。保存耐冰冻植物的种质常采用此方法,但对於冷敏感植物则不宜采用。 3.2　超低温保存超低温保存是指在-80℃以下的超低温中81保存种质资源的一整套生物学 技术。在超低温条件下保存材料,可以大大减慢、甚至终止代谢和衰老过程,保持生物材料 的稳定性。超低温常用乾冰(-79℃)、深冷冰箱、液氮(-196℃)及液氮蒸汽相(-140℃)获 得。由於冷源通常选用液氮,因此超低温保存又称液氮保存或??(-196℃)保存[7]。保存的 材料有原生质体、悬浮细胞、愈伤组织、体细胞胚、胚、花粉胚、花粉、花药、茎尖分生 组织、芽、茎段等。但较大的材料如茎头、胚或试管苗,由於高度液泡化的细胞易受到严 重伤害,解冻後只有分生细胞能够重新生长。幼小的球形胚比老龄胚存活率高。成熟胚或 是完全不能恢复生机,或是需要特殊处理。超低温保存的一般程序是:无菌组织培养和细胞 悬浮培养;加入冰冻保护剂;以适当速度冷却或经预处理之後置於液氮中;培养物在液氮中 贮藏;解冻;反覆冲洗,除去冰冻保护剂;检定生活力;对恢复活力的培养物再培养;诱导生长 并再生植株。影响植物种质超低温保存效果的因素很多,其中某个环节处理不当,就可能影 响整个系统的成功,影响存活率。 3.2.1　预培养　是指在添加高渗物质或冰冻保护剂的培养基中培养。已有试验证明苹果 茎尖生长点在含冰冻保护剂的培养基中预培养4?,对提高存活无效应。 3.2.2　冰冻保护剂　冰冻保护剂可以降低冰点和水的过饱和点,提高玻璃化消失点;增强 溶液粘性,阻止冻晶生长,使之较易达到玻璃化状态;促进结冰早期各阶段进行保护性脱水 。最常用的冰冻保护剂是????和甘油,已经证明????是最有效的冰冻保护剂。?lric和 ?inkle等利用10%????+8%葡萄糖+10%???的复合保护剂,使枣椰树愈伤组织的存活率接近 100%。 3.2.3　冰冻　细胞伤害主要发生在冰冻过程中。为了防止冻害,必须防止内冰晶的形成。 不同的植物材料对冻害的敏感程度不一样,因此,降温的方法也不一样。常用的降温方法有 :慢冻法。样品以0 1～10℃/?in(1～2℃/?in最常用)的速度将温度降至-30～-40℃或-100 ℃,平衡一段时间後再转入液氮。这种方式对悬浮细胞和原生质体比较适合。?artha发现, 草莓生长点的降温速度必须严格控制在0 5～1 0℃/?in范围内,否则存活率明显下降。快 冻法。将样品直接放入液氮或其蒸汽相中冷冻和贮存,温度下降的速度为300～1000℃/?in 。在这样快的降温速度下,贮存物很快跨越冰晶形成区,-140℃以下冰晶不再增生,细胞内 呈「玻璃化」状态。此法可保存含水量较少的植物材料,如花粉和种子以及高度脱水的抗 寒植物的枝条等。分具冷冻法。又可分为先慢後快和先快後慢两种。前一种方法更为常用 ,它结合了慢冻法和快冻法两者的优点。起先的慢冻逐渐使细胞失水达到保护性的脱水,形 成高浓度的溶质,以防止第二步快冻时受损伤。 3.2.4　解冻　解冻必须迅速,很多实验表明,冰冻过的植物组织培养物在35～40℃水浴中 解冻比在室温(25±2)℃下解冻效果好。但有些研究结果与此并不一致。冰冻後的组织和 细胞很脆弱,解冻时应避免剧烈摇动。解冻後的样品应置於冰浴中,以防止高温下冰冻保护 剂的毒害。在35～40℃水浴中解冻时应防止过热伤害,待冻融後即可取出。近几年来,人们 对几十种顽拗性种子超低温保存,发现效果并不好,仅可可幼胚、椰子胚经处理後产生了幼 苗[22],其余如黄皮等只保持生根、分化愈伤组织的能力。超低温保存种质用液态氮作冷 源,液氮罐就是冷冻器和贮存容器,除了每隔40～60?补充1次液氮外,不需机械空调设备及 其它管理措施,免去了检测活力和繁殖更新等繁杂程序,从而节约了人力物力。但也存在涉 及的试验材料面窄,长期连续使用冻存材料的再生能力衰退,组织培养後代遗传稳定性仍未 解决(茎尖生长点有可能解决这一问题)等问题。 摘自《福建果树》2002.2 --

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