这是 http://www.cpedu.net/xkb/g2/shengwu/lishenying/lisheny.doc 的 HTML 档 氮是植物生长所必需的主要营养元素。在农业生产中，氮被视为衡量土壤肥力的一个重要 指标。它是农作物获得长期稳定高产的基本条件。 高等植物只能利用以离子形式（NH4和NO3）结合的氮。所以，空气中的分子态氮只有 通过工业或生物固定转化成其他化合物，才能进入生物体系统。 自然界中通过微生物将分子氮转化为含氮化合物的过程称为生物固氮。 固氮作用是地球上氮素循环的一个重要部分。自然界中由固氮生物完成的分子氮向氨 的转化占2/3以上，而通过工业合成或其他途径合成的氨只有1/3左右。 禾谷类作物是人类赖以生存的粮食作物。由於缺乏共生固氮作用和大多数土壤缺乏氮 素，因而氮肥往往成为农业增产的限制因素。为此，当前世界迫切需要开辟氮素肥源，以 增产粮食。 70年代以来，人工合成氮素化肥的能源耗费和环境污染问题开始显露出来，於是生物 固氮研究更加受到世界各国的重视。现代农业科学中生物固氮已成为极富挑战性的研究课 题。 长久以来，人们始终乐此不疲的探究着生物固氮的途径和机理，其最终目的是： · 提高现有固氮生物的固氮能力； ·提供高效优质的微生物肥料，为农业开发肥源； ·用分子生物学等方法促使不固氮作物固氮； ·人工模拟固氮酶在常温常压下还原分子氮，使氨的工业合成有一个历史性突破。 一、生物固氮及其基本过程 1、固氮微生物的类型 （1）自生固氮微生物 大多数固氮微生物在土壤或水体中自行生活，称为自生固氮微生物。分好氧与厌氧两 种。好氧性自生固氮菌在我国分布广、种类多，常见的有圆褐固氮菌和棕色固氮菌等。它 的固氮能力较强；厌氧性自生固氮菌也称巴氏梭状芽孢杆菌（产生芽孢时菌体呈梭状）， 严格厌氧。 （2）共生固氮微生物 共生固氮微生物是在植物体内和植物共同生活产生固氮作用的微生物。共生固氮微生 物可以分为两类：一类是与豆科作物互利共生的根瘤菌，以及与桤（音漆）木属、杨梅属 和沙棘属等非豆科植物共生的弗兰克氏放线菌；另一类是与红萍（又叫满江红）等水生蕨 类植物或罗汉松等裸子植物共生的蓝藻。由蓝藻和某些真菌形成的地衣也属於这一类。 能与非豆科植物共生结瘤固氮的微生物是一种放线菌（Frankia）。已报道有8科、24 属、200（400？）多个种的木本双叶植物与之共生结瘤固氮。这类植物统称为放线菌结瘤 植物。它分布广、适应性强，在各种生态条件下都能生长。它们固氮力强大，是陆地生态 系统中的重要供氮系统。 （3）联合固氮微生物 有些固氮微生物如固氮螺菌、雀稗固氮菌等，能够生活在玉米、雀稗、水稻和甘蔗等 植物根内的皮层细胞之间。这些固氮微生物和共生的植物之间具有一定的专一性，但是不 形成根瘤那样的特殊结构。这些微生物还能够自行固氮，它们的固氮特点介於自生固氮和 共生固氮之间。这种固氮形式叫做联合固氮。 在农业生产中，利用共生固氮微生物与植物的固氮作用是极其重要的，这其中，又以 根瘤菌与寄主豆科植物的共生最重要。（表 ）。 2、根瘤菌与豆科植物根的共生 1886年德国学者H·赫尔利格尔首先发现豆科作物的根瘤具有同化利用N2的能力。 在过去的30年间，关於固氮根瘤菌同豆科植物之间的遗传共生问题的研究已经取得了 很大进展。已知根瘤菌属中有十几种根瘤菌。其单独生存时并不进行固氮，只有与豆科植 物建立了共生关系时才能进行正常的固氮作用。 （1）根瘤菌侵染豆科植物根部的过程 根瘤菌侵染豆科植物的根部，形成一种具有复杂结构和高度分化的特殊植物 器官——根瘤。固氮作用就是在根瘤所提供的厌氧环境中进行的。这个过程大致可概括为 ： 土壤中的根瘤菌吸收豆科植物的根分泌物後产生鞭毛→贴附於根毛→根瘤菌分泌生长 素使根毛卷曲→根瘤菌大量繁殖，形成感染丝状体（侵染线）→刺激寄主根细胞分裂→根 瘤形成→根瘤菌发育成能固氮的「类菌体」，在固氮酶、植物豆血红蛋白等共同作用下， 开始固氮过程（下图）。上述每一步都要受到植物基因和固氮菌基因的控制。 由此可看出，根瘤菌的运动、繁殖及至固氮功能行使，都需寄主供给碳水化合物，但 它同时将其所固定的氮供应给寄主，以此「互惠互利」，互相依存。如下图所示。 （2）根瘤菌的寄主专一性 根瘤菌和豆科植物相互作用的一个显着特徵是其宿主特异性。不同的豆科植物寄主需 要不同的根瘤菌。 研究者们发现，从不同种豆科植物根上分离的根瘤菌在形态和培养特性上彼此相似， 但是回接植物都表现很强的寄主专一性。往往在其他种的豆科植物上不能存活。如从羽扇 豆根上分离出的根瘤菌不能在豌豆上形成根瘤，反过来也一样。来自豌豆、扁豆和菜豆的 根瘤菌能够在这一群豆科植物的各个种上结瘤。因此，豌豆根瘤菌和羽扇豆根瘤菌之间的 区别可以根据寄主专一性来判断。根据根瘤菌的寄主专一性，可将根瘤菌分为六个互接族 群：苜蓿群、车轴草群、豌豆群、菜豆群、羽扇豆群、大豆群。同族的寄主范围相同，不 同族的寄主范围不同。 形成互接种族的原因：根瘤菌与宿主豆科植物的相互识别涉及根瘤菌表面粘多糖和植 物凝集素的相互作用。根瘤菌胞外粘多糖包括异源多糖、中性β糖原、脂多糖等。它们可 能是信号分子，或者是产生信号的物质分子，或者是侵入过程所需的粘性物质。凝集素是 一类植物糖蛋白，它一端与根瘤菌的次级受体结合，另一端与宿主植物根毛上的类似受体 结合，以辨认和结合。只有同族豆科植物根毛分泌的蛋白质与同族根瘤菌细胞表面的多糖 物质才能产生特异性结合。 3、固氮酶 固氮作用必须在固氮酶的催化下才能发生。一些重要的进展也是始自固氮酶的分离。 该酶在0℃下都很不稳定，在有氧气存在时也很不稳定，所以直至1965年才得到其粗制品 。目前，已从许多种固氮生物中分离出这种酶。 （1）组成：钼铁蛋白+铁蛋白 一般的固氮酶都是由钼铁蛋白和铁蛋白组成。这两种蛋白单独存在时都不呈现酶活 性。只有二者整合在一起，形成复合体後，才具有催化氮还原的能力。 （2）结构： ‧‧铁蛋白：由2个相同亚基组成的二聚体。每分子二聚体中含有4克原子铁和4克原 子酸不稳定性硫，组成一个[4Fe-4S]的原子簇。代表不同属种的多种固氮生物固氮酶铁蛋 白的一级结构都已测定。其中都不含色氨酸，酸性氨基酸均高於硷性氨基酸。各种属间的 同源性为45%~90%。说明铁蛋白的基本结构是较为保守的。目前，棕色固氮菌固氮酶铁蛋 白的晶体结构已在2。9Å分辨水平进行了测定。 ‧钼铁蛋白：由2个α亚基和2个β亚基组成的四聚体（α2β2）。一些固氮生物的固 氮酶钼铁蛋白的一级结构也已测定。其氨基酸序列有47%~66%相似，保守性都相当高。尤 其是半胱氨酸，其位置往往相同或相近，推测是与铁、钼形成配位键所必需。钼铁蛋白α 亚基的N末端区的长度与同种铁蛋白的C末端的长度具有对称关系，这种对称关系可能会决 定活性固氮酶复合体的形成，并与不同种的两组分蛋白互补时，显示与酶活性密切相关。 现在棕色固氮菌和巴氏梭菌的钼铁蛋白晶体结构分别完成了2。9Å 和3。0Å的X衍射分析 （ 1992年）。 ‧固氮酶组成的多态性 上述由钼铁蛋白和铁蛋白组成的固氮酶系统（MoFe）曾一度被认为是固氮微生物中起 固氮作用的唯一系统。但最近20年来的发现动摇了这一观念。1980年Bishop等发现在棕色 固氮菌中存在着另一套缺钼条件下使用的由钒铁蛋白和铁蛋白组成的固氮酶系统（VFe） 。这被称为第二套固氮酶系统。这一系统已在一些固氮生物中得到证实。近年，在棕色固 氮菌中发现了不含钼和钒的第三套固氮酶系统，它也是一种双蛋白系统（FeFe）。 第二套和第三套固氮酶系统、固氮基因的差异、以及一些新的发现，都给生物固氮研 究提出了一系列生理生化、遗传与进化方面的问题，对这些问题进行深入的研究，将有利 於揭开生物固氮催化机理之谜。 （3）特性 ·对氧的敏感性：固氮酶对氧极为敏感。氧对固氮生物是有害的，它既阻遏固氮酶 的合成，又破坏固氮酶活性。而好气固氮微生物又离不开氧。所以高效率的固氮作用一般 是在微氧条件下进行。因而固氮生物都有其特定的防氧机制。 固氮酶防氧机制： （1）分隔保护：例如蓝藻的固氮功能主要在异形胞中进行，这种细胞外有一层防氧 进入的糖脂外膜，胞内缺少光解放氧的PSⅡ，其中戊糖磷酸途径的两种酶活性较低，而超 氧化物歧化酶和脱氢酶活性都较强，从而使异形胞保持微氧环境，避免了氧对固氮酶的伤 害。 又如豆科植物的根瘤中，由根瘤菌演变来的类菌体外有一层类菌体周膜，瘤的内皮 层内侧细胞排列紧密并形成间隙，这两者都参与氧进入根瘤的调节。并且，根瘤内还含有 作为氧载体的豆血红蛋白，在氧分压高时吸氧，於是，瘤中氧浓度降低，保护固氮酶免受 氧的伤害；在氧分压低时则放氧，保证氧化磷酸化的进行。从而满足固氮过程对能量的需 求。 （2）呼吸保护：即当固氮微生物细胞中氧分压高时，通过剧烈增高呼吸，消除耗固 氮酶附近的氧，从而保护固氮酶。这是极耗能的过程。 （3）构像保护：在固氮酶周围氧分压过高时，活性「关闭」，氧分压下降後，活性 「启动」。这种现象是由於固氮酶与一个或更多的稳定因子如蛋白质、磷脂等结合改变构 像而得到保护。如在棕色固氮菌中固氮酶常与一种耐氧的2Fe—2S蛋白（Fe—SH蛋白或称 Shethna蛋白）结合形成一个大复合体而得到保护等等。 氧对固氮酶的伤害，也是阻碍固氮生物应用的一个大问题，是当今研究的热点之一 。 ·异种两组分的交叉互补性：不同来源固氮酶的铁蛋白和钼铁蛋白可以交叉组合。 但物种间仍具有明显的特异性。一般生理类型和亲缘关系近的互补组合能力强；反之，则 不易组合或组合後没有催化活性。互补後的固氮酶活性远不如同一来源的高。说明彼此间 有共同的活性中心和作用机理。至於两种蛋白如何结合，为什麽异源结合後活性表现大相 迳庭？这些问题至今悬而未决。 ·底物的变通性：固氮酶是多功能的氧化还原酶，它的分子量很大，但底物却很简 单。除了还原N2外还能还原多种类型的底物。其中大多数的分子末端都具有NN、NC或CC的 三键或潜在三键。如乙炔、丙二烯、环丙烯等，都是生物界少见的。目前新底物还在不断 被发现。这些底物虽然没有生理意义，但是有的专性强，检测简便，如乙炔，可以作为测 定固氮酶活性的主要方法。有的可以作为鉴定是否存在固氮酶的依据，如环丙烯。许多底 物还可以用以探测固氮酶络合部位等等。 4、生物固氮过程 （1）固氮酶的基本酶促反应 固氮酶蛋白所催化的固氮反应，由於三维X—射线晶体结构研究的结果，使其有可能 在原子水平上进行分析。反应的基本过程可表示如下： 即：N2+16MgATP+8e-+8H+ → 2NH3+16MgADP+16Pi+H2 在上面的图示中，电子供体（还原剂）将电子输送给固氮酶体系，降低体系的氧化还 原电位，以具备催化还原底物的能力。这一系列活动是从铁蛋白接受电子开始的。铁蛋白 接受电子後呈还原态，与钼铁蛋白相结合形成复合体，在MgATP参与下将电子经钼铁蛋白 传递给底物N2，使之还原成产物NH3。在底物氮存在时，部分电子经过固氮酶和ATP实现固 氮所固有的放H2反应。 天然的电子供体在不同固氮微生物中略有差异。有铁氧还蛋白（Fd）、黄素 氧还蛋白（Fld）、红素氧还蛋白（Rubredoxin）等。在离体实验中，通常用低电位（— 400mV）的人工电子供体连二亚硫酸纳（Na2S2O4）代替Fd或Fld。 固氮过程是一个相当复杂的过程。如下图所示。 （2）固氮酶催化机理 英国的Postgate综合近年来各实验室的研究成果，提出了一个固氮酶催化机理模型。 该模型内容如下： 氧化的铁蛋白从还原态的电子供体如Fld、Fd等接受一个电子，变成还原态铁蛋白， 在MgATP协同作用下，铁蛋白与钼铁蛋白结合，形成复合体，传递电子给钼铁蛋白，同时 伴随ATP水解成ADP+Pi，铁蛋白又恢复为氧化态。铁蛋白和钼铁蛋白解离。如此循环2次後 ，N2取代2H结合到钼铁蛋白上，而释放出H2。再陆续接受6个电子後，经过形成E=N—NH2 和E=M中间物，最後释放出NH3。 二、共生结瘤固氮的分子基础 1、根瘤菌基因 （1）结瘤基因：根瘤菌—豆科植物共生固氮的建立，需要大量的根瘤菌基因参与。与 结瘤有关的基因可分为共同结瘤基因和宿主专一结瘤基因两群。 共同结瘤基因：为细胞分裂及宿主根毛弯曲所必需。若这些基因中的一个发生突变， 则不能结瘤。就核苷酸序列和功能来说，这些基因似乎是保守的，在不同根瘤菌之间可以 互换。 宿主专一结瘤基因：参与宿主选择。并与根毛卷曲的位细胞分裂的效率及持久性有关 。这些基因是不保守的，具根瘤特异性。在不同根瘤之间不能替换。由於这些基因的生化 功能还不很清楚，因此暂时只能以「共同」和「宿主专一」称呼它们。 （2）结瘤基因的调节基因 （3）固氮基因 根瘤菌的固氮基因一般分为两群： nif基因：与克氏肺炎杆菌固氮系统同源。为共生固氮所必需。 fix基因：与克氏肺炎杆菌固氮系统不同源。功能尚不甚清楚。 目前研究较为深入的固氮基因：苜蓿根瘤菌、豌豆根瘤菌、大豆根瘤菌的固氮基因。 苜蓿根瘤菌的固氮基因（6个nif基因和14个fix基因）分布於200kb的大质粒上，豌豆的 nif和fix连锁较紧，也位於质粒上。快生型大豆根瘤菌的固氮基因也在大质粒上，而慢生 型大豆根瘤菌的所有固氮基因（14个nif和fix基因，分属9个操纵子）均位於染色体上。 2、豆科植物基因 （1）早期结瘤素基因：在根瘤形成阶段表达的基因，该基因的表达与感染 过程有关。有实验表明，早期结瘤素在细菌与宿主根系接触後一周内即出现在无菌感染的 「空瘤」内。说明宿主和细菌之间相互作用以及共同结瘤基因的激活对早期结瘤素基因的 表达是必需的。如大豆早期结瘤素N—75，有可能作为一个细胞壁蛋白，在早期成瘤过程 中起作用。 （2）晚期结瘤素基因：在根瘤发育後期表达的基因。晚期结瘤素参与根瘤 中的固氮和氨同化。如豆血红蛋白（Lb）是晚期结瘤素中最具代表性的一个。现已鉴定出 了4个豆血红蛋白基因和2个豆血红蛋白基因的3个内含子。豆血红蛋白基因及别的晚期结 瘤素基因，都只特异的在根瘤中转录，并且多数晚期结瘤素似乎与豆血红蛋白是协同表达 的。 早期和晚期结瘤素基因的表达及功能行使与特定的共生阶段相吻合。因此，研究结瘤 素基因表达系统的分子基础显然是富有吸引力的。近十几年来，结瘤素的鉴定、结瘤素基 因的克隆及表达的分析都颇有进展。目前，有关结瘤素的研究 主题有：基因表达的调控方式、基因产物的细胞学定位以及由RNA序列分析所得到的信息 判断结瘤素基因间的同源性。 三、生物固氮的基因工程 把生物固氮的基因工程运用於农业生产，目标主要有2个：一个是把非豆科 作物，尤其是禾谷类作物转变成固氮作物；二是提高现有固氮作物的固氮能力。 使非豆科植物转变为固氮作物 要使普通的非固氮植物的细胞，从遗传上转变为具备固氮能力的特殊细胞，必须具备 如下四个条件： ‧‧‧‧ 固氮菌的全部固氮基因都应能在同一植物细胞中适当的表达； ‧ 固氮酶复合体能够恰如其分的加工和组装； ‧ 具有一个厌氧的微环境； ‧ 提供能源ATP和NADPH。 要实现上述条件，是一项十分复杂而艰巨的工作。可能的途径有： ‧ 用带有固氮基因的质粒转化植物细胞的叶绿体。从而在叶绿体基因启动子的控制下 进行正常的表达。但固氮酶的氧抑制作用仍然是一个难以解决的问题； ‧ 把豆科植物的结瘤基因导入其他作物细胞，使之能够对固氮菌的感染作出恰当的反 应； ‧ 改变根瘤菌的遗传结构，使它能与非豆科作物的根结合，并形成根瘤，从而使非豆 科作物获得固氮能力。即扩大根瘤菌的宿主范围。 ‧ 直接把固氮基因导入非豆科植物。该途径比较困难。原因有二：其一，固氮酶复合 体对於氧的抑制作用十分敏感，若直接将固氮基因导入非豆科植物，该受体作物很难为固 氮酶提供适合的厌氧环境；其二，由於豆科植物根瘤菌固氮所需的ATP几乎占植物总量的 1/5，因此也要求新形成的固氮植物必须具有极高的ATP形成速率，方可使能量供求平衡， 进而达到固氮的目的。而这也并非易事。但是作为一种尝试，70年代末科学家们已把克氏 肺炎杆菌的固氮基因转入大肠杆菌，使大肠杆菌也能直接利用空气中的氮。日本科学家将 方法稍作变通，把固氮基因转移到水稻根际微生物中，结果可使这种微生物给水稻提供 1/5的需氮量。 固氮螺菌的发现：1979年，巴西科学家杜柏林纳（Doberiner）首次证实能与禾谷类 作物根际联合共生固氮的根际微生物。并对其分子生物学特性进行了较细致的研究。该类 菌的固氮效率虽不及豆科植物根瘤菌，但它能与玉米、水稻、 小麦等禾本科作物共生固氮，而且分布范围广，又能产生植物生长素，因而日益受到人们 的重视。随着对固氮螺菌研究的日益深入，或许有可能为禾谷类作物固氮开辟一条希望之 路。 提高现有固氮作物的固氮能力 接种高效固氮的根瘤菌剂。但接种的高效固氮根瘤菌在竞争结瘤时往往竞争不过土着 根瘤菌，从而使形成的根瘤实际上多为无效根瘤。严重影响了固氮效果。为了克服这一点 ，人们尝试的方法主要有2种：一是结合施用抗菌素来抑制土着根瘤菌；二是结合接种对 土着根瘤菌有抑制作用的拮抗菌。 提高现有固氮作物固氮能力的研究内容 （1）将固氮效率高的大豆根瘤菌固氮基因簇导入高结瘤能力的大豆根瘤菌中 （2）将大豆根瘤菌nifKD和nifH基因导入高结瘤能力的大豆根瘤菌。 （3）将外源共生基因导入豆科作物根瘤菌，提高其结瘤或固氮能力。 （4）培育具抗药基因的根瘤菌。 主要参考资料： 1、《固氮之光——共生固氮体系中最佳结瘤固氮控制模型的研究》 洪国藩 宋鸿遇主编 湖南科技出版社1997.8 2、《植物发育的分子机理》许智宏 刘春明主编 科学出版社1998.1 3、《第二次绿色革命—21世纪的农业》刘荣乐编着 科学技术文献出版社1995.7 4、《基因工程与农业》丁勇 吴乃虎等编着 科学技术文献出版社199547 -- 人类之所以伟大，正在於他是一座桥梁而非目的； 人类之所以可爱，正在於他是一段跨越与完成。 --

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