http://memo.cgu.edu.tw/Secretariat/news/45/research/research_3.htm 一、摘要 体外培养之组织的工程技术是一个快速发展的领域，并影响众多医疗的应用。 技术的障碍存在於对组织发育的生理生化与培养条件参数了解不足以及昂贵的培养成本。 然而，藉由可控制并维持特殊环境的生物反应器，使得在体外三维环境中所培养之组织可 以表现活体组织的生理功能，进而改善体外培养组织之品质。如何有效将细胞接种於多孔 性三维骨架(scaffold)，增加物质传递的效率，并提供体外组织的机械刺激，也是生物反 应器开发时要考虑的要件!除此之外，藉由自动化及标准化之体外组织培养之密闭系统， 生物反应器可降低生产成本，使体外培养之组织可以广泛又有效被应用於再生医疗。 二、细胞接种於三维骨架 对於细胞骨架的接种来说，为将分离的细胞散布置於骨架中，首要的目的即建立 三维的培养体系，此系统的建立，对於组织生成的进展，将扮演一个重要的角色。一般来 说，细胞能均匀的接种於骨架上将使得组织的生成能均匀分布，然而，就实际上而言，即 使一个小的骨架（如直径5mm × 宽2mm），欲使高密度的细胞均匀且有效的分布於整个骨 架上，仍然是一个相当大的挑战。之前常用的接种方法为将细胞静态接种於骨架上，研究 显示此方法接种效率低、细胞分布不均、骨架周边缺乏细胞以及接种的效果应操作的方式 或因人而有所差异。为了改善此缺点，有人利用搅拌瓶反应器(Spinner flask)（图1a） ，将骨架置於其中，藉由搅拌产生对流使得悬浮细胞流入骨架中，相较於上述方法，此法 可提升接种效率以及细胞的分布。然而，利用搅拌瓶反应器接种细胞时，由於流体的对流 无法进入骨架内部，这将导致整体接种效率下降以及使得骨架表面细胞密度较高而分布不 均。研究也显示，如果利用对流将细胞放入骨架的原理，相较於静态及搅拌瓶的接种方式 ，三维骨架的接种可使用直接流灌法及结合自动化的生物反应器来更有效及更均匀的接种 细胞。此外，流灌式的接种也可与流灌式反应器（图1d）整合在一起，不但能有效的接种 细胞，也能同步进行组织培养。此系统的建立，不但使工程组织制程更有效率，也对於组 织与反应器之间的处理与转移的风险降低。 三、增加物质传递的效率 长久以来，体外三维组织培养的氧气以及可溶性养分的提供，一直是极重要的限 制因素。早期的研究显示，当组织团块直径超过1mm其组织内部即产生组织缺氧和坏死的 现象，只有周边的组织保有活细胞。然而，就工程组织来说，组织置换所需的移植体其大 小必须至少数公厘以上，因此，质传的限制为一极大的挑战。 有研究分别比较静态培养、搅拌瓶培养以及旋转壁式培养对於软骨组织生长的影 响，静态培养的结果显示组织内部由於质传效率不佳导致组织发育不良（图2a）；而搅拌 瓶培养（图1a）的结果显示，相较静态培养组织内部质传效率有提升，不过组织周边由於 质传的边界浓度效应，导致组织周边生长不佳（图2b）；为了改善上述两者的缺点，旋转 壁式培养反应器（图1b）被开发出来，藉由流体回转的环境，它可以产生动态的层流，有 效的降低养分及废弃物扩散的限制并产生较少的剪应力，此实验结果显示软骨组织生长发 育佳，其组织生化及生医特性皆优於静态培养及搅拌瓶培养（图2c）。此结果显示，旋转 壁式生物反应器对於工程组织的发展甚重，也对於体外器官系统模式提供一个很好的方向 。 针对一些具高度代谢性功能的细胞，有研究者开发一种生物反应器，即利用流灌的方式将 培养液直接或由周边流经半透性的中空纤维膜（图1c），具有增加养分及氧气的质传效果 。这种流灌的培养方式，对於工程组织来说，培养液直接流经已接种细胞的多孔性三维骨 架（图1d），可充分改善骨架周边及内部孔洞的质传限制。若将此方法结合到生物反应器 的设计上，将可提升细胞的存活、生长以及功能。 将特殊的机械力应用於三维的细胞结构不仅对於工程组织发展有帮助，对於一些 多效性的干细胞具有促进直接分化的效果。然而特定的机械力（如大小、频率、连续、间 断、循环）是刺激部分组织的；此外，不同发展阶段的工程组织可能需要不同的机械条件 以增加细胞外基质的累积以及结构组织的发展。对於这种情况，生物反应器可以扮演一个 重要的角色，不但提供一个再生的控制环境，更可以确立特定机械力对於三维结构的应用 。（图1e）生物反应器对於机械力应用於三维结构来说，可使得传统加强细胞分化或是细 胞外部基质沉淀於工程组织的方法之应用层面更广。此外，数量上的分析、电脑化的应力 模式再加上一般体内组织的活性和生物反应器中的工程组织，可使得我们可以更精确的比 较体内及体外的机械条件，也可以帮助我们了解物理复原的条件，将使得组织更适於为病 患所接受。 四、组织移植体的制造 为了恢复受伤或生病组织的外部体内组织工程以细胞为培植体，拥有相当大的 潜力，对於一些严苛无效的物理治疗阶段和生活品质的改善将引起革命。然而，目前主要 的挑战为如何将实验室研究规模的生产模式放大到适用於临床效益和经济可接受的状态， 且如何符合GTP（Good Tissue Practice）的规定也是必要的。创新生物反应器系统的发 展，对於细胞组织工程的临床试验也是极重要的。Advanced Tissue Sciences (ATS) 公 司使用生物反应器来大规模生产组织工程产品DermagraftR。此自动化系统，於细胞增生 时期可自动更换培养液，且这套封闭生物反应器系统可接种及培养96张组织工程的皮肤移 植体，并可自动流灌培养液。尽管如此，这套系统仍有一些缺点，如控制不佳以及产生一 些有缺陷的产品，使得整体生产成本提高。 先进的控制系统促进生物反应器生产体外组织之程序自动化及快速发展。如 Millenium Biologix公司即结合OSTEOTM生物反应器系统以及ACTEXTM控制系统，开发一套 有效的先进临床组织培养系统。首先是病患的组织检测及取样，再藉由生物反应器系统来 分离细胞、使细胞生长、接种特定细胞型态於骨架上、於适当的环境下培养使生成一适当 的移植体，这些不同的阶段过程可以直接於同一封闭系统下自动执行（图3）。这个系统 的建立对於很多病患来说无疑是一大福音，不但病患可以拥有自体自源的组织，也降低了 移植的许多争议问题。这个系统也将减少庞大且昂贵的GTP组织制造问题及减少操作手续 。 五、结论 生物反应器可以提供精密的监控系统和制程，适用於体外培养三维组织，使我 们更容易进行特定生物、化学或物理因素对於体外组织之功能研究。然而如果要从实验室 规模进展到工业量产规模，生物反应器转必须要由高度弹性用途，转换成一特定用途的生 物反应器，以实现标准化的生产制程。这些进展也让体外三维组织的制造走向经济且自动 化的方向，未来临床上大规模的体外组织生产是可预期的。 六、参考文献 Ivan Martin, David Wendt and Michael Heberer（2004）Review：The role of bioreactors in tissue engineering. Trends in biotechnology. 22, 80-86 -- 恐惧是一回事 继续恐惧又是另一回事 --

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