真是感谢您详细的解说 我目前的情况是这样： 我想看的蛋白是p-proteins 所以lysis buffer里面含有phosphatase inhibitor是可以接受的 但是我想看的pathway里头有 PP2A 而且他是在蛮上游的地方 所以我才会想到 phosphatase inhibitor会不会把PP2A给抑制掉 造成PP2A下游的蛋白表现受影响? 学长跟我说这是一个切面的问题 收蛋白时lysis buffer把所有反应都停止 这只是一个切面 而不会影响整条pathway 但我还是愚钝 有点想不通? ※ 引述《biolenz (lenz)》之铭言： : ※ 引述《metalbi (真有趣)》之铭言： : : 收蛋白的步骤用的buffer有哪些 : : 我的方法有两种 : : ㄧ种是用sampling buffer : : 另依种是除了sampling buffer以外还有lysis buffer : : 请问这两种萃取法有差吗?? : : 因为我查了我们实验室的lysis buffer的配方 : : 里面竟然还有phosphatase inhibitor : : 不知道是否会将蛋白质的phosphatase都抑制掉了 : : 这样对於实验结果会有差耶!! : : 烦请大家解答 : 收蛋白 (萃取蛋白) 首先要看你是用什麽细胞， : 植物跟动物跟细菌都不太一样。 : 所谓 lysis buffer 里头可能含有一些 detergent 或是 enzyme : 前者打破细胞膜，後者打破细胞壁 (像植物或是细菌) : 至於 buffer 系统，PBS、Tris、Tricine、HEPES 很多种， : 除非特别用途，否则都差不多，就看习惯了。 : 小结一下，lysis buffer 里头含有 : 1. buffer system 主要维持 pH 稳定 (细胞内很多 pH 很极端的胞器) : 2. protease inhibitor (防止蛋白质被分解) : 3. phosphatase inhibitor (防止磷酸化的蛋白被分解，非必要，看实验) : 4. detergent (打破细胞膜，或是萃取膜蛋白) : 有 ionic 与 non-ionic 的两种，前者常用如 Triton X-100、NP-40 : 後者如 deoxycholate : 5. enzyme (看要做啥就放啥，去 DNA 还是去掉特定蛋白，或是打破细胞壁) : 说实在其实 lysis buffer 是个很广义的名词，只要以上的元素就算是， : 至於元素怎麽选择，每个实验室甚至每次实验可能都不一样。 : 另外你所谓 sampling buffer 我想应该就是 sample buffer， : 这个定义跟配方就比较统一了。 : Sample buffer 又称为 Laemmli buffer，是 1970 年发在 Nature : 上的一篇文章其作者的名字。本篇作者发明了 SDS-PAGE，首度使用 : Stacking gel 跟 Running gel 的系统，配合上经过 sample buffer : 处理的蛋白质样品，可以得到很好的分离效果，我们现在用的方法， : 就是那时候的，配方都没有变过。 : 可参考如下： : Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the : assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680–85. : Sample buffer 里头一样有 detergent (SDS)，有些人会直接拿这个 : buffer 来萃取蛋白质，不过因为 sample buffer 内含 glycerol : (为了让 loading 的时候蛋白质会沉在 well 里)，整个黏呼呼的。 : 不一定适合所以萃取方式。 : 总结，反正要萃取蛋白质不外乎 buffer、protease inhibitor (必要) : 另外再加 detergent，没有 detergent 就用液态氮直接打破它。 : 其它加进去的，大多是实验上有其他用途才会加。 : 所以建议你可以仔细想想你们实验室的 protocol 都是拿来做什麽的， : 或是问问学长姐比较快喔。 -- 找板请到以下专用板 找板专用 市民广场 报告站长 Ptt咬我 WelcometoPTT 欢迎 Σ批踢踢新手服务中心 [okcool] --

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