神经科学新技术─ 如何解开大脑的神秘讯息？ http://pansci.asia/archives/104814 文／陈摘文｜於台大与德国歌廷根大学取得电机学士与神经科学博士学位，毕业後到美国 珍利亚研究所进行博士後研究，於 2015 年回台任教，目前任职於国立阳明大学神经科学 研究所。 每天当你睁开双眼，流畅的高画质影音便自动传入你的大脑，毫不费力地，大脑对这巨量 的讯息进行即时分析，辨识出影像中的每张面孔，跟记忆中上百张脸比对。依据过去的经 验，你做出了决定。你的念头在一瞬之间抵达了位於左脑的语言皮质，在那里合成出你的 反应──「亲爱的，早安。」这一切都发生在几个毫秒之间，你的大脑是怎麽办到的？ 窃听神经元讯号 人类的大脑由上千亿颗神经细胞组成，每颗神经元的型态不尽相同，可是他们都透过调变 细胞膜内外的电位差来传递讯号。一个多世纪以前，科学家就已经知道神经细胞的讯号， 是以全有（1）或全无（0）的数位方式传递，犹如电脑的运作方式。神经细胞的 1，是大 小约 0.1 伏特，持续约 0.001 秒的膜电位脉冲，科学家们称之为「动作电位（action potential）」。 一般认为，大脑神经元所有的沟通跟运算，都是透过动作电位来执行。这也难怪，一百多 年来，科学家绞尽脑汁想要记录神经元的电讯号，就如同特务在电话交换机夹上窃听器一 般，科学家在大脑中插入电极来窃听神经元的秘密。可是，神经细胞的讯号非常微小，想 要窃听到单一细胞的讯号，电极必须要放在细胞旁边，甚至要插到细胞里面才行。然而， 大脑像是个超高密度的积体电路，每立方公厘的组织里挤着数万个神经元。不够微小的电 极，或是实验中最细微的震动，都是精密的神经网路最致命的杀手。 这些困难都难不倒锲而不舍的神经科学家。随着科技的发展，如头发一般细的微电极，超 灵敏、低杂讯的放大器，以及稳定的机器手臂陆续发明。这让科学家能将电极准确插入脑 中，并在麻醉或甚至是清醒的大脑里分离出单一神经元讯号，让我们一窥大脑运作的秘密 。到目前为止至少有十多位诺贝尔奖得主的研究（包括 2014 年生医奖的 3 位获奖者） ，都与神经电讯号的纪录与分析有关。 然而，即使在科技进步的今天，用微电极记录脑中的每一个神经细胞，仍然是遥不可及的 梦想。因为这代表着要在脑中插入无数的电极，并精准放置在每个细胞旁边。以目前最先 进的电极阵列，在一立方公厘大小的空间里最多能记到约十多颗神经元，只占总细胞数的 千分之一。试想，如果一本书只能随机读取千分之一的文字，是要如何了解书中的内容呢 ？这是一直以来困扰科学家的问题──到底要如何大规模记录每一个神经元所传递的讯号 呢？ 分子探针潜入细胞 如果有一种超小型探测器，小到能轻易的放到细胞里，量测细胞的讯号并且用无线的方式 传送出来，这样我们是否有机会大量窃取神经细胞的密码呢？这听起来像是天方夜谭，可 是 2008 年诺贝尔奖得主钱永健（Roger Yonchien Tsien） 竟然在 20 多年前就想到了 办法。他的实验室开发出一系列超小型的无线生理讯号探针。令人惊讶无比的是，这些探 针竟然比细胞小了 1000 倍以上，而且可以由细胞自行合成，称之为分子探针（ molecular probe）。 生物学家很早以前就知道，细胞其实是复杂无比的微型工厂，无时无刻根据储存在 DNA 序列中的基因蓝图，制造出细胞生存所需的超小型零件──蛋白质。根据不同 DNA 序列 可制造不同的蛋白质，有的帮助细胞运送货物，有的负责侦测细胞内的生理反应，有的协 助细胞产生电讯号。 海洋生物学家下村修（Osamu Shimomura）发现，海中水母的细胞竟然会制造可发出萤光 的蛋白质。换句话说，早在千万年前，演化的爱迪生就已经发明了超小型的分子灯泡，在 黑暗中照亮着大海。钱永健有个充满野心的想法：既然演化创造了能侦测生理反应的蛋白 质，以及可发出萤光的蛋白质，我们是不是能结合这两种蛋白的功能，把细胞内的生理讯 号转换成萤光的讯号，传送给在细胞外观察的科学家？ 运用基因工程的技术，以及不断的尝试，钱永健的实验室成功结合不同功能的蛋白质，创 造出许多崭新的萤光分子探针。这包括在 1997 年与宫脇敦史（Atsushi Miyawaki）首度 发表的钙离子萤光探针「变色龙（Cameleon）」。 Cameleon 是可由细胞自己合成的蛋白质分子，会根据周遭环境的钙离子浓度，发出不同 亮度的萤光。在细胞质内表现 Cameleon，科学家便可透过观察细胞发出的萤光强弱，即 时地推测细胞内钙离子浓度的高低。在神经细胞之中，钙离子浓度与细胞电讯号（即神经 动作电位）有非常紧密的关连。每当神经细胞产生动作电位时，细胞内的钙离子浓度都会 有短暂且微小的上升。读取这些细微的钙离子浓度变化，将能让科学家间接推知神经细胞 所传送的电讯号密码。 超敏感萤光探针 在钱永健的 Cameleon 推出之後，日本的中井淳一（Junichi Nakai），德国的格里斯贝 克（Oliver Griesbeck）等人陆续尝试改良钙离子萤光探针的敏感度，希望能将神经电讯 号透过钙离子探针转换成光讯号。我在美国珍利亚研究中心（Janelia Farm Research Campus）进行的博士後研究，也以改良钙离子萤光探针的敏感度为主题。运用大规模突变 与自动化功能筛选，我们的团队在 2013 年发表了新一代的超敏感钙离子萤光探针 GCaMP6。GCaMP6 对微小钙离子讯号的敏感度比过去提高了十倍之多。这让科学家第一次 能够可靠地在活体动物的脑中侦测到单一细胞、单一个动作电位所产生的萤光讯号。 用光学影像侦测神经讯号有什麽样的好处呢？首先，非侵入式的萤光造影免除了插入电极 造成的伤害。目前最常使用的双光子显微镜技术，运用红外线脉冲光来激发萤光分子，可 穿透数十层的细胞，侦测到大脑皮质深处单一细胞的微弱萤光讯号。其次，光学显微镜可 以清楚解析细胞的型态与位置，让我们了解所记录细胞的身份。最重要的，光学方法让大 规模的神经讯号读取不再是梦想。运用基因转殖，科学家可在脑中每一颗神经细胞都放入 钙离子侦测蛋白。结合视野较大的镜头，可同时记录数百或数千颗神经细胞。这种纪录规 模是过去运用微电极所无法想像的。 大规模读取神经讯号 短短几年间，运用萤光探针大规模读取神经讯号的技术已被广泛运用在果蝇、斑马鱼及小 鼠等模式生物研究。去（2015）年 12 月，一个日本东京大学的团队甚至将此技术成功运 用在读取灵长类动物的神经讯号。观察活体脑中细胞的实验大都需要在头部固定的情况下 进行，以避免影像的振动。但实验者仍可透过虚拟实境，研究大脑对外界刺激的反应与编 码。当中野心最大的计画之一，是由微软共同创办者艾伦（PaulAllen）资助 3 亿美金的 「大脑天文台（Brainobservatory）」计画，期望用最新科技探索脑内的小宇宙。这个计 画的短期目标是对小鼠视觉皮层的编码功能做一个彻底的绘测，采用的便是以钙离子萤光 探针进行大规模神经纪录的方法。 萤光探针的发展让我们轻易的记录脑中上千颗神经细胞的讯号，可是全脑的神经细胞还是 远大於这个数量──我们有办法观察脑中每一个神经细胞的讯号吗？ 2013 年， 美国阿伦斯（Misha Ahrens）与凯勒（Philipp Keller）的团队运用钙离子萤 光探针及光片照明显微术（Light sheet microscopy），在斑马鱼幼鱼中成功地达成了这 个历史性的目标。斑马鱼幼鱼的皮肤与大脑都接近透明，整个大脑的长宽不到 0.8 mm， 厚度不到 0.3 mm，总共约只有 10 万颗神经细胞。利用转基因的方式，他们在幼鱼脑中 每一颗细胞中都植入了钙离子敏感的萤光蛋白。结合超高速影像系统，他们几乎可同时观 察脑中所有神经细胞的活性。 https://www.youtube.com/watch?v=9Fp4FL-RKQo 在实验当中，幼鱼被包埋在透明凝胶中无法自由移动。可是透过纪录控制肌肉的运动神经 ，实验者可以推知小鱼「希望」往前游，往右转或是往左转。运用这种方法，这两人的团 队解析了幼鱼脑中将外界刺激转换成行为控制讯号的完整回路。在达成记录斑马鱼全脑神 经细胞的里程碑之後，科学家们正致力发展更新的技术，希望能在哺乳类动物（如小鼠） 的脑中上也能够记录所有神经细胞。 相较於斑马鱼，小鼠大脑与人脑更为接近。而且许多神经退化与精神方面的异常，都可以 在小鼠上进行模拟。如果能在清醒的小鼠脑中全面记录分析每个细胞的功能，或许我们能 够更进一步找出失忆症、自闭症、忧郁症或知觉失调症的大脑中，究竟出了什麽样的问题 。 突破活体观察的障碍 然而，即便是小鼠，同时观察脑中所有的神经细胞仍是目前无法达到的目标。小鼠的脑比 斑马幼鱼的脑大了上千倍，共有约 7000 万颗细胞。目前用光学技术能够观察到的细胞， 仍局限於最表面的大脑皮质。较深的脑区，如掌管记忆的海马回与掌管情绪的杏仁核等， 仍需透过安装较为侵入式的内视镜才可观察。主要原因是光线通过大脑组织时会产生散射 ，无法在脑中深处聚焦成清晰的影像。最近虽然有许多实验室发展出让脑组织变成透明的 方法，如史丹福大学戴瑟若斯（Karl Deisseroth）的 Clarity，与清大江安世院士的 Focus clear 等，可是这些技术都只能用在死去的组织，而无法用在活体的观察。 目前有许多正在进行中的研究正尝试着提高活体萤光影像的观察深度。这包括从天文物理 学借来的「适应性光学（adaptive optics）」技术。天文学家在使用地表望远镜观察远 处的星体时，也同样面临了光线通过大气层散射造影像模糊的问题。适应性光学於是利用 可任意变形的镜子，补偿不同路径光线的相位，重新达成聚焦。透过这样的方式，神经工 程学家希望能透视到更深的脑区。 除此之外，还有透过三光子激发、光声造影等方式来提高影像深度。但这些方法都需要同 时发展能配合的分子探针。或许不久的将来，活体光学影像的观察深度又将有巨大的突破 。不论这些技术最终如何发展，可以确定的是，在物理、生物、工程、分子、认知等领域 的通力合作之下，脑科学的研究与发现将不断带给我们更多惊奇与赞叹。 本文原刊载於《科学月刊》2016 年 7 月号，由作者授权刊出。 -- 很有趣的技术，第一次听到觉得非常有前瞻性 XD --

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