血管新生与神经病变 谢丰舟 　　脑部血管病变是相当常见的疾病，血管病变所致的死亡人数中，脑仅次於心脏，而且 脑血管病变所致的後遗症相当严重，经常导致残障。一旦缺乏血流供应，脑细胞迅速死亡 ，残存的细胞通常不足以维持正常功能。因此了解在发育及疾病过程之中，脑与其血管的 密切关系就变得十分重要。 　　由於近几年来，血管新生与神经疾病分子机转的相关研究进展快速，因此探究脑的血 管新生与神经疾病的关连正是时候。在神经病变的过程中，血管新生（angiogenesis）与 神经细胞新生（neurogenesis）两者都相当明显。在血管新生、神经细胞新生与神经病变 三者之间，VEGF（vascular endothelial growth factor，血管内皮生长因子）扮演了关 键性的角色。VEGF最初发现於血管系统，其相关的讯息传递也已清楚。近几年来VEGF在神 经系统的角色日渐显着。从它在stroke及motor neuron disease等神经病变的角色来看， VEGF及其下游的讯息传递可能是这些疾病具有厚望的治疗标的。 脑的血管新生 　　中枢神经系统经由血管新生（angiogenesis）的过程获得其血流供应系统，也就是由 原有血管，萌生出新的微血管，再形成血管网络。另一血管形成方式－vasculogenesis， 即由先驱细胞长成血管，并未见於中枢神经系统。 　　在胚胎发育的早期，血管由软脑膜（pia mater）侵入脑组织，并且向脑室集中。某 些穿透较深的血管到达脑室周围并分出次级血管围绕脑室，甚至再向远侧的软脑膜延伸。 在向心与离心的血管之间造成一个灌流勉强足够的区域（marginally perfused border zone）或称分水岭（watershed）。此区对周产期缺血（perinatal ischenria）最为敏感 ，这就是脑性麻痹（cerebral palsy）之病灶所在。 　　到了成人期，人类脑部循环之血流量达50ml/100g/min。它占心博输出的20%，是一般 器官单位重量血流的10倍。脑循环的另一特色为其微血管层面的blood brain barrier (BBB)。这是由内皮细胞的tight junction连结而成，阻碍了许多种分子由血液进入中枢 神经。BBB在许多疾病状态发生缺损，例如stroke或脑瘤，进而导致脑水肿，脑压升高甚 至死亡。 　　诸多血管新生因子中，最受注目的应属VEGF，VEGF在脑部广泛表现。它可由缺氧，经 转录因子ＨIF-1 (hypoxia-inducible factor-1)诱发。有趣的是，去除脑部HIF-1的小鼠 ，VEGF的表现依旧而大范围缺血的伤害仍可获改善。中枢神经系统内VEGF讯息传递网络的 tyrosine kinase receptorS及下游的protein kinases与其他器官相彷，包括了VEGFR-2 ，某些情况还有VEFGR-1, MAPKs， PI3K/Akt以及Rho/Rac。 脑疾病的血管新生 　　中枢神经的血管新生，在发育过程最为清楚，但亦可见於组织移植（tissue graft） 及肿瘤生长（tumor growth）。神经组织移植於脑部之後，就会长出血管，其血管来源及 生长过程依植入者为固态组织或离散细胞，位置在脑室或脑组织，是异种或同种移植而异 。脑肿瘤的血管新生现象显示，成人脑部能够产生新血管，但这些血管缺乏BBB，以致造 成脑水肿并且易於出血。不过这些新生血管也许可以成为抗血管疗法（antiangio genesis）的治疗标的。 　　缺氧或缺血在多数组织可以引发血管新生，CNS也不例外。在成人脑部，纯粹的缺氧 较为罕见，但缺血则多有所在。一过性的大范围脑缺血，例如心跳停止，导致许多脆弱的 神经细胞死亡，海马回的CA1区域以及脑部或脊髓的分水岭区域最为脆弱。更常见的是局 部性缺血，造成局部组织死亡，引发中风。若血流在30分钟内迅速恢复，则为TIA (transient ischemic attack)不致造成永久性的伤害。事实上，一过性的缺血可能有助 於维护脑部免受下次缺血的伤害，此谓ischemic tolerance或pre-conditioning。 　　解剖研究显示脑缺血会刺激血管新生。脑中风的动物模式显示血管新生现象在中风发 生後1-2星期明显可见。血管新生的现象在边缘缺血区（ischemic penumbra）最为明显。 此区血流减少，但非完全断绝。在此区血流的些微差异就足以决定细胞存活与否。实验显 示，尽力让此区细胞存活可以有助於复原。不过目前，缺血导致的血管新生在临床上的影 响如何，尚无新知。 　　在大鼠，以VEGF增加血管新生可以减轻神经病变。这种治疗策略也许临床上有用，不 过新生血管的渗漏性可能导致脑水肿。在VEGF之外，并用angiopoietin或HIF prolyl hydroxylase inhibitor可能有助於减少新生血管之渗漏。不过此一血管新生过程通常需 要几天，可能缓不济急，因为神经细胞在缺血数分钟之後就开始死亡。倒是对可以预测或 再发性的中风，血管新生疗法可能有其发挥功能之处。目前为止，VEGF在临床上用於治疗 心脏及肢体的缺血，并无确实疗效。VEGF在脑部缺血的临床效果如何仍属未知。在动物中 风模式中，在1小时内给予VEGF，因增加脑水肿，故效果不佳，但48小时後给予，则有助 於病情。看来，VEGF给予的时间点至为重要。 　　某些脑疾病会导致出血，而非缺血，例如berry aneurysm会引起蜘蛛膜下出血，而 vascular malformation则会导致脑组织的出血。大部分的情况其机制并不清楚，不过目 前已知有两种遗传情况，包括hereditary hemorrhagic telangiectasia或 Osler-Rendu-Weber disease以及部分KRIT1基因突变者的cerebral cavernous malformation。前者由endoglin基因的突变所致。Endoglin是内皮细胞上的homodimeric membrane glycoprotein，缺氧或缺血会引发endoglin的表现，因此可能与缺血导致的血 管新生有关，但为何endoglin基因的突变会造成脆又薄的血管，易於出血，则未可知。 成人的神经细胞生成（neurogenesis） 　　成人组织也需要细胞新生来应付细胞老化或死亡。成人组织均具有adult或tissue stem cell。这些干细胞能自我更生（self-renewal）但却非全能性（totipotant），一 般只能产生某一特别组织或器官中特定的细胞。在细胞快速淘换的成人组织中，如骨髓、 小肠、皮肤，此一现象最为明显，脑组织亦然。 　　脑的细胞再生至少见於下列二处：1. Subventricular zone (SVZ)：在侧脑室的边壁 之中；2. Subgranular zone (SGZ)：位於hippoccampal dentate gyrus。在这些区域中 ，神经细胞的新生可以藉由BrdU标定及某些神经细胞标帜如double cortin (Dox)的表现 来确认。在鼠类，SVZ产生的神经细胞会沿着rostral migratory stream抵达olfactory bulb，以补充因programmed cell death而减少的interneuron。在人类，SVZ所新生的神 经细胞，其最终去向仍然不明。在dentate gyrus的SGZ所产生的神经细胞则进入附近的 dentate granule cell layer，变成成熟且具有功能的granule neurons，它们可能参与 记忆和学习。 　　癫痫或脑部缺血所致的脑伤害会刺激神经细胞生成并使新生细胞移动到受创区域，可 能藉此进行修复。在Huntington disease, Alzheimer disease及其动物模式均有神经细 胞生成增加的证据。Liu等人最近报告，在amytorphic lateral sclerosis (ALS)的小鼠 转殖模式，脊髓的神经细胞新生增加，而神经细胞的前身细胞从central spinal canal迁 移到ventral horn区域motor neuron死亡之处。看来，CNS会增加神经细胞新生并将之导 引到受伤地区似乎在前述几种疾病都可以发现。此一现象也许可以做为修复受损CNS的线 索。 　　不少生长因子均能促进神经细胞新生，包括FGF-2, EGF, BDNF (brain-derived neutrotrophic factor), erythropoietin, heparin-binding EGF like growth factor 以及VEGF。在小鼠脑皮质体外培养以及成鼠活体的SVZ和SGZ之中, VEGF可以增进BrdU进入 表现未成熟神经细胞标帜的细胞。VEGFR-2参与这些过程。不过，VEGF对astrocyte的生长 促进似乎是透过活化VEGFR-1。看来，生长因子似乎可以用於治疗性神经细胞新生，尤其 若能透过非侵入性给予方式，例如经由鼻子。此举并可避免脑以外的副作用。不过，对不 同的情况可能需要不同的生长因子，例如VEGF能够促进angiogenesis以及neurogenesis， 因此也许可以用於中风，而不适合退化性疾病。 　　成人的脑细胞新生仍然扑朔迷离，特别是VEGF引发成人细胞新生的现象仍难了解。环 境强化（euvironmental enrichment）及学习经验会引发海马回的神经细胞生成。大鼠若 成长在身体接受环境强化或在Morris water maze接受训练，其海马回VEGF的表现会增加 。若藉由脑内注射表现VEGF的AAV vector以增加海马回VEGF的表现，则 hippocampus-dependant的associate及spatial learning均有所增进。此一现象与 VEGFR-2有关。相反地，若使用RNAi来减损hippocamgus中VEGF的表现，则可以抵消环境强 化所致的神经细胞生成。 神经保护(neuroprotection )及神经再生（neuroregeneration） 　　文献上，VEGF在神经系统的相关报告是以其neurotrophic effect着称。Sondell等人 报告，在培养的Superior cervical及dorsal route ganglion neurons，VEGF会促进轴突 生长及细胞存活，而此作用系经由VEGFR-2相关的机制。Silverman等人则报告，VEGF能改 善organotypic midbrain explant culture的神经细胞存活。 後续的研究指出，VEGF能 引起培养的神经细胞或cortical explant的神经突触在数目上及长度上的增加。此一作用 涉及VEGFR2，MAPK及PI3K/Akt之讯息传递。Rho/Rac讯息传递也可能与VEGF引起的突触生 长有关。 　　除了这些促进生长的效果之外，VEGF也能保护神经细胞免於某些伤害，例如VEGF可以 减少immortalized hippocampal neuron遭受serum withdrawal或缺氧後的死亡。此一作 用系经由活化VEGF-2，PI3K/Akt及NK-Kb。VEGF也可以藉由类似的机制保护缺氧後之大脑 皮质细胞培养，此外，caspase-3活化之降低可能也在其中扮演某些角色。VEGF可以保护 培养的hippocampal neurons免於glutamate及N-methyl-D-aspartate之毒性。 　　VEGF可以改变急性和慢性的神经退化过程。此作用可能是经由VEGF对血管、神经细胞 ，其至包括胶细胞的作用。大脑缺血会刺激VEGF的表现，藉此刺激大脑的神经细胞生成。 局部使用VEGF可以减少brain infarct的大小，而VEGF静脉注射会改进缺血引起的神经症 状。相反地，静脉注射VEGF的抗体则会增加infarct的大小。有人经腹腔注射会吸附VEGF 的fusion protein却反而会减小infarct之大小。这显示VEGF对脑缺血的影响并非全为正 面。 　　在大鼠之中脑动脉阻断後1-3天将VEGF注入侧脑室，会缩小缺血区之大小，且神经学 变化较轻微。此效果在第三天最为显着。相较之下，神经细胞的生成是在3-28天并进而刺 激血管生成。因此VEGF可以在急性期发挥神经保护作用，但神经细胞生成及血管新生似乎 与长期之复原有关，VEGF似乎对脑缺血亦有保护作用。 　　VEGF与退化性脑疾病可能也有关连。Kalaria等人报告，Alzheimer disease患者脑中 之反应性astrocyte团块对VEGF得免疫反应增加。VEGF基因promoter区之SNP与发生 Alzheimer disease的风险似乎有关连。 　　在周边神经方面，VEGF亦有其角色。肌肉注射encoding VEGF之plasmid DNA可以改进 大鼠之糖尿病神经病变（以streptozotocin引发者）。另外肌肉注射naked VEGF DNA对兔 子之缺血性神经病变也有类似效果。最令人期待的莫过於VEGF与ALS的关连。ALS引起脊髓 与脑干lower motor neuron以及运动皮质upper motor neuron的丧失。ALS大部分为偶发 性，少部份可见基因突变。Carmeliet等发现VEGF基因中与hypoxia-responsive有关序列 的突变会引起肢体无力，神经性肌肉萎缩，以及脊髓及脑干之motor neuron丧失。VEGF可 以增进培养的脊髓motor neuron之存活，包括wild type及VEGF 8/8小鼠。此一保护作用 系经由VEGFR-2媒介，而且有一个neuropilin 1 co-receptor参与。 　　在人类中，某些会减低血液中VEGF含量的遗传变化会增加ALS之风险。在表现人类ALS 突变基因的转殖鼠，其病情可藉由腹腔或肌肉注射VEGF而减轻。另外藉由可以上溯至 motor neuron的VEGF-expressing lentiviral vector之肌肉注射也有同样疗效。这些结 果显示VEGF对神经组织的基因治疗颇有厚望。 　　VEGF对其他的motor neuron disease可能亦有疗效，包括X-linked spinal and bulbar muscular atrophy (Kennedy’s disease)以及与androgen receptor expansion 有关的肌肉萎缩。後者可能干扰与CREB-binding protein有关的转录工作，而此一蛋白质 正是VEGF基因的调控者。总之，VEGF已知与在遗传型与表现型均各有特色的两种motor neuron disease有关。 结论 　　综合上述的种种研究，在运用血管生成治疗神经疾病方面可以有二个途径： 1.利用VEGF来revascularize缺血的脑组织 2.利用VEGF之neuroprotective及neuroregenerative功能 前者对中风後再发性高的病患可能有用，例如中风後有25%的病人在3年内会再发，急性心 肌梗塞後亦是中风好发的情况。因此，对这些病人可以考虑使用VEGF来预防中风。至於後 者，也许可以应用於ALS， diabetic　neuropathy………..。不过VEGF 对神经疾病真正 疗效如何，仍待观察。 取材文献 Greenberg DA et al: From angiogenesis to neuropathology. Nature 438:954,15 December,2005 -- 约三年前的文章 虽然研究是日新月异 还是有参考价值 本文转录自 谢丰舟教授随笔 http://neuroscience.ntu.edu.tw/ep/01.htm --

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